重組人白細(xì)胞介素－15搖瓶生產(chǎn)工藝優(yōu)化

楊 梅，許崇利，2

(1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，吉林吉林 132022;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062)

白細(xì)胞介素 －15(Interleukin－15，IL－15)是Grabstein［1］于1994年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，與IL－2具有類似的生物活性。它具有促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ及TNF－α的作用［2］。近年來的研究表明，IL－15在抗腫瘤、抗微生物感染和治療艾滋病等方面均有重要的作用［3－5］。人體多種組織和細(xì)胞均可表達(dá)IL－15，其中骨骼肌、胎盤、腎臟、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及脂多糖刺激的外周血單核細(xì)胞表達(dá)較豐富。IL－15有其自身高親和力的特異性受體IL－15Rα，IL－15與其受體IL－15Rα的親和力是IL－2與 IL－2 Rα 的 1000倍［2］，將有可能代替IL－2成為抗感染、抗腫瘤強(qiáng)有力的生物制劑。但是天然IL－15產(chǎn)量低、不易大量制備，為此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)IL－15蛋白的基因工程菌株，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，從而為IL－15生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 菌株BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)由吉林化工學(xué)院基因工程藥物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基 M9Ⅰ培養(yǎng)基:1.6%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%磷酸氫二鉀、0.1%磷酸二氫鉀、0.01% 氯化銨、0.06% 硫酸銨、0.05% 硫酸鎂、0.25%十二水磷酸氫二鈉;M9Ⅱ培養(yǎng)基:0.5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.5% 磷酸氫二鉀、0.35% 磷酸二氫鉀、0.35% 磷酸氫二銨、0.025% 硫酸鎂、2 mol/L大腸桿菌用微量元素;M9Ⅲ培養(yǎng)基:0.5%酪蛋白、0.52%三水磷酸氫二鉀、0.2%磷酸二氫鉀、0.12%硫酸銨、0.05% 硫酸鎂、0.02% 氯化銨、0.1%甘油、0.7% 十二水磷酸氫二鈉、0.1mol/L 氯化鈣、2 mol/L大腸桿菌用微量元素。

1.3 主要試劑 乳糖和卡那霉素(Kanamycin)購自Promega公司;β－巰基乙醇購自北方同正生物公司;蛋白Marker購自長春寶泰克生物公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、過硫酸胺(AP)購自華美生物公司;凝膠成像儀、電泳儀購自Bio－Rad公司。

2 方法

2.1 搖瓶種子的培養(yǎng) 挑取BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)單菌落轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，50 mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基20 mL(含50 μg/mL卡那霉素)，37℃ 200 r/min培養(yǎng)12～14 h。

2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，含50 μg/mL卡那霉素)，200 r/min，37℃培養(yǎng)，37℃誘導(dǎo)。

2.3 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)IL－15表達(dá)影響 將種子液按2%接種量分別接種于三種改良的M9培養(yǎng)基(M9Ⅰ、M9Ⅱ、M9Ⅲ)中，于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)，待菌體密度 OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.5 g/L的乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取樣，SDS－PAGE檢測 IL －15 表達(dá)量［6－7］。

2.4 發(fā)酵初始pH對(duì)IL－15表達(dá)的影響 將M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值分別調(diào)為 6.5、7.0、7.5，然后分裝于200 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，按2%接種，于37℃ 200 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.5 g/L的乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

2.5 乳糖最佳誘導(dǎo)濃度對(duì)IL－15表達(dá)的影響將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃ 200 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0 時(shí)，分別加入終濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

2.6 誘導(dǎo)溫度對(duì)IL－15表達(dá)的影響 將M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至7.0，然后分裝于200 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，按2%的接種量接種BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)種子液，分別于28、35、37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.5 g/L的乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

2.7 培養(yǎng)和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL－15表達(dá)的影響 將種子液按2%的接種量接種于M9Ⅱ發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃ 200 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.5 g/L的乳糖，分別于1、2、3、4、5 h取樣，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

3 結(jié)果

3.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)IL－15表達(dá)影響 如圖1所示，IL－15在三種改良的M9發(fā)酵培養(yǎng)基中均有表達(dá)，但在M9Ⅱ培養(yǎng)基中的表達(dá)量最高，利用GDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL－15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量30.2%(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液SDS－PAGE電泳圖

3.2 發(fā)酵初始pH對(duì)IL－15表達(dá)的影響 如圖2所示，不同初始pH值對(duì)IL－15蛋白表達(dá)水平有明顯影響，其中pH值為7.0時(shí)，IL－15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL－15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的29.6%(圖2)。因此，選擇 pH 7.0為最佳初始pH值條件。

3.3 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)IL－15表達(dá)的影響 如圖3所示，不同的乳糖濃度對(duì)IL－15蛋白表達(dá)量的影響不同，當(dāng)乳糖濃度達(dá)到1.5 g/L時(shí)IL－15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL－15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的32.3%(圖3)。因此乳糖濃度控制在1.5 g/L較好，可以得到更高的表達(dá)水平。

圖2 不同pH值發(fā)酵液SDS－PAGE電泳圖

圖3 不同濃度乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵液SDS－PAGE電泳圖

3.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)IL－15表達(dá)的影響 如圖4所示，不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL－15蛋白表達(dá)量有較大的影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)IL－15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL－15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量36%(圖4)。考慮到菌體生長速度，最后確定搖瓶培養(yǎng)溫度為37℃，誘導(dǎo)溫度為37℃。

圖4 不同培養(yǎng)溫度發(fā)酵液SDS－PAGE電泳圖

3.5 不同培養(yǎng)、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL－15表達(dá)的影響在對(duì)數(shù)生長前期進(jìn)行誘導(dǎo)，最有利于菌體生長和產(chǎn)物表達(dá)。只有工程菌處于對(duì)數(shù)生長時(shí)期，目的蛋白表達(dá)水平才最高，一旦工程菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期再升溫，目的蛋白表達(dá)水平反而會(huì)迅速下降。如圖5所示，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí)，IL－15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL－15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的30.7%。因此，選擇4 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵液SDS－PAGE電泳圖

4 討論

乳糖以其無毒、價(jià)廉的特點(diǎn)，使得人們期望能夠利用乳糖作為工業(yè)化生產(chǎn)的誘導(dǎo)物。然而，由于乳糖本身會(huì)引起細(xì)胞在轉(zhuǎn)運(yùn)以及生理代謝等方面的一系列復(fù)雜的變化，需要對(duì)菌體生長及誘導(dǎo)條件進(jìn)行更為精細(xì)的研究及優(yōu)化。本文深入研究了以乳糖作為誘導(dǎo)劑時(shí)，對(duì)T7啟動(dòng)子調(diào)控的重組產(chǎn)物表達(dá)及菌體生長的影響及其規(guī)律，從中分析并尋找出適宜的誘導(dǎo)條件及誘導(dǎo)物濃度。

摸索搖瓶發(fā)酵條件對(duì)確定發(fā)酵罐發(fā)酵工藝有著一定的借鑒意義［8－10］，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵條件為發(fā)酵起始pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、乳糖誘導(dǎo)濃度1.5 g/L、菌體生長密度OD600達(dá)到1.0時(shí)加入乳糖、誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵條件是穩(wěn)定的，在后續(xù)的工作中，可以此為方向進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的摸索，從而為乳糖作為誘導(dǎo)劑最終應(yīng)用于重組基因工程藥物IL－15的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考和借鑒。

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