吉祥安神丸微生物限度檢查方法的探討

杜爾再 阿瓦古麗·哈得爾 伊麗娜

（新疆巴州藥品檢驗所，新疆 庫爾勒 841000）

吉祥安神丸為蒙藥成方制劑,具有調(diào)經(jīng)活血，補氣安神的功效，臨床上主要用于治療月經(jīng)不調(diào)，產(chǎn)后發(fā)燒，心神不安，頭昏頭痛，腰膝無力，四肢浮腫，乳腺腫脹等，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準 蒙藥分冊》，該藥品為口服給藥制劑，處方中含有益母草、沙棘、訶子、紅花、木香等成分。根據(jù)其給藥途徑和處方，應(yīng)進行細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)的測定以及控制菌—大腸埃希菌、大腸菌群的檢查?！吨袊幍洹?005年版規(guī)定建立微生物限度檢查法時，應(yīng)進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法及控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該制劑的細菌、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌的測定。本試驗按照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，建立吉祥安神丸的微生物限度檢查法并加以驗證［1］，即采用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗確定細菌數(shù)檢查法，采用白色念珠菌、黑曲霉菌試驗確定霉菌和酵母菌數(shù)的檢查法。按《中國藥典》規(guī)定，在采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法等方法處理樣品后，加入以上5種菌，培養(yǎng)后回收率達70%以上，證明該法有效消除了藥品對細菌的抑制作用，可用該法進行藥品微生物限度檢查。本試驗所用樣品均由新疆巴音郭楞蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院提供，先取1個批號的樣品，選用敏感菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌進行預(yù)試驗，摸索出合適方法后再用3個批號的藥品進行試驗。

1 儀器與材料

1.1 儀器：凈化工作臺、均質(zhì)器、電子天平、生物安全柜、細菌培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱。

1.2 標準菌種：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]；本試驗所用菌種均為第三代，以上菌種均由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)基、稀釋劑及試液：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：071116）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：080616）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：080708）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（BacC）（批號：071224）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：081127）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）（批號：0806042）、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（批號：080218）、4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）（批號：070604），（以上培養(yǎng)基生產(chǎn)單位為中國藥品生物制品檢定所，由北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司提供）；0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：080925），以上稀釋劑自配；靛基質(zhì)試液。

1.4 供試品：吉祥安神丸（新疆巴音郭楞蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院；批號：20080608、20080615、20080725）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)的驗證［1］

2.1.1 菌液制備：①取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。②取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。③取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉的斜面培養(yǎng)物，加5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備：稱取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL制備成1:10供試液。

2.1.3 方法驗證預(yù)試驗：選用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌3種敏感菌株進行預(yù)試驗，摸索出合適方法。

常規(guī)法：取1:10供試液1mL，分別加入敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌各50～100cfu，立即注入相應(yīng)培養(yǎng)基15～20 mL，待培養(yǎng)基凝固后，置規(guī)定的溫度下倒置培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24h，白色念珠菌培養(yǎng)48h。

培養(yǎng)基稀釋法：取1:10供試液0.5，0.2mL，分別注入平皿，加入敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌50～100cfu，注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，待培養(yǎng)基凝固后，置規(guī)定的溫度下倒置培養(yǎng)24h。

2.1.4 方法驗證預(yù)試驗結(jié)果以上預(yù)試驗的回收率結(jié)果見表1。

表1 敏感菌株對幾種預(yù)試驗方法的回收率結(jié)果比較

根據(jù)上述預(yù)試驗結(jié)果,采用常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法（供試液：0.5mL/皿）試驗時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均小于70%，表明吉祥安神丸對細菌抑制作用明顯；采用培養(yǎng)基稀釋法（供試液：0.2mL/皿）試驗時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%，表明該法有效消除了吉祥安神丸對細菌抑制作用；采用常規(guī)法試驗時，白色念珠菌回收率為100%，說明吉祥安神丸對霉菌和酵母菌沒有抑制作用。初步確定吉祥安神丸細菌計數(shù)方法為培養(yǎng)基稀釋法（供試液：0.2mL/皿），霉菌和酵母菌計數(shù)方法為常規(guī)法。

2.1.5 細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法的驗證［1］取3個批號的吉祥安神丸樣品，細菌按培養(yǎng)基稀釋法（供試液：0.2mL/皿）進行細菌回收率試驗，霉菌和酵母菌按常規(guī)法進行加菌回收率試驗，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿）5種陽性菌回收率試驗結(jié)果

上述試驗說明,采用培養(yǎng)基稀釋法（供試液：0.2mL/皿）試驗時，3個批號的藥品中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%，該法可用于藥品細菌數(shù)檢查；采用常規(guī)法試驗時，3個批號的藥品中白色念珠菌、黑曲霉菌回收均大于70%，該法可用于藥品的霉菌和酵母菌數(shù)檢查。

2.2 控制菌檢查方法驗證［1］

2.2.1 大腸埃希菌檢查方法驗證：①試驗組：取1:10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）中，同時加入大腸埃希菌10～100cfu，35℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物0.2mL接種至5mL MUG培養(yǎng)基試管中，35℃培養(yǎng)24h，在365nm紫外燈光下觀察熒光，然后再進行靛基質(zhì)試驗。另取培養(yǎng)物在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，35℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。②陰性菌對照組：取金黃色葡萄球菌作為陰性菌對照試驗菌，方法同試驗組。結(jié)果見表3。

2.2.2 大腸菌群檢查方法驗證：①試驗組：取1:10供試液1ml接種至9ml乳糖發(fā)酵管培養(yǎng)基中，同時加入大腸埃希菌10～100cfu，35℃培養(yǎng)24h。另取培養(yǎng)物在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，35℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。②陰性菌對照組：取金黃色葡萄球菌作為陰性菌對照試驗菌，方法同試驗組。結(jié)果見表4。

表3 大腸埃希菌試驗結(jié)果

表4 腸菌群試驗結(jié)果

3 討論

具有抑菌性藥物的微生物限度檢查結(jié)果的準確性，主要取決于樣品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖。檢驗時應(yīng)排除其抑制作用，使之不干擾染菌限度檢驗，結(jié)果方屬有效。本試驗通過預(yù)試驗，采用排除法確認可行的方法。3批樣品的驗證試驗結(jié)果表明：①采用培養(yǎng)基稀釋法對吉祥安神進行細菌數(shù)的測定，3種規(guī)定試驗菌的回收率均大于70%，可把外界影響、制劑工藝因素（如原材料處理）和操作者的主觀因素減少到最低，更客觀、公正、科學，符合《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法的規(guī)定，方法可行。②采用常規(guī)法進行霉菌及酵母菌數(shù)的測定，兩種規(guī)定試驗菌的回收率均大于70%，方法可行；③采用常規(guī)法檢查吉祥安神中的大腸埃希菌和大腸菌群，方法可行。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊[S].1998:86.

[2]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：化學工業(yè)出版社,2005:附錄70-79.