單因素法考察蒙藥清喉顆粒的提取工藝

楊萬政 蒲維維 白音夫 王 捷

(1.中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京100081;2.中國氣象局北京城市氣象研究所，北京100089;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010020;4.內(nèi)蒙古宇航人高技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限責任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011517)

清喉顆粒由金銀花、牛蒡子、玄參、沙棘等7味藥材組成的蒙藥，具有清透熱邪、利咽散結(jié)之功效。為提高中藥保健品的質(zhì)量，對其制備工藝條件進行了研究和考察。本文分別采用HPLC法河分光光度法，分別以溶媒、醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)和浸泡時間6個單因素來考察清喉顆粒的提取工藝。據(jù)文獻報道，綠原酸的分析方法有薄層掃描法［1，2］、高效液相色譜法［3，4］、分光光度法［5，6］等;牛蒡子苷的測定方法有高效液相色譜法［7，8］和薄層掃描法［9］等?？傸S酮的分析方法一般采取分光光度法［10，11］。

1 材料與儀器

1.1 藥材:金銀花、薄荷、牛蒡子、玄參、蘆根購于北京同仁堂藥店;沙棘購于水利部高原圣果有限公司;余甘子購于西藏藥廠。

1.2 儀器:LC10－ADvp型高效液相色譜儀;V－550紫外可見分光光度計;Millipore純水機;Adventurer電子分析天平。

1.3 標準品:綠原酸標、牛蒡子苷、蘆丁購于中國藥品生物制品檢定所。(標準品批號)

1.4 試劑:甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 綠原酸的含量測定:色譜條件:色譜柱 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;檢測波長327nm;流動相 乙腈－水(20:80)，磷酸調(diào)節(jié) pH=4;流速 1mL·min－1;柱溫30℃;分別準確移取濃度為8.5 mL的綠原酸對照品溶液0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用 50%甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=54645x–122210，R2=0.9997。結(jié)果表明綠原酸進樣濃度在8.5～68μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20?l進樣測定峰面積。由標準曲線方程計算樣品溶液中綠原酸的含量。

2.1.2 牛蒡子苷的含量測定:色譜條件:色譜柱 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相乙腈－水(30:70);流速1mL·min－1;檢測波長 278nm;柱溫30℃;

分別準確移取濃度為 8.7μg·mL－1對照品溶液 0.25、0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=11918x －2845.6，R2=0.9996。結(jié)果表明牛蒡子苷進樣濃度在 2.175 ～69.600μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μL進樣測定峰面積。由標準曲線方程計算樣品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.1.3 總黃酮的含量測定:精確稱取6.1mg蘆丁標準品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，備用。分別準確移取以上述對照品溶液 5、7、9、11、13、15(mL)于 25mL 容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置 10min。

以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。結(jié)果表明總黃酮濃度在4.880 ～14.640μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

取1mL樣品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL 5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，靜置10min，進行測定，以標準曲線方程計算樣品含量。

2.2 提取工藝單因素考察

有效成分得率=nCV/M×100% 其中:n為提取液稀釋倍數(shù);C為提取液中有效成分濃度，mg·mL－1;V為提取液體積，mL;M為藥材的重量，g。

綜合評分:因金銀花為方中君藥，綠原酸為金銀花的主要有效成分，具有較高的藥理活性，故綠原酸為重要指標之一，權(quán)重系數(shù)定為0.4。牛蒡子苷為牛蒡子的有效成分，且牛蒡子為方中臣藥，因此，牛蒡子苷作為評價提取工藝的一個指標，權(quán)重系數(shù)定為0.3。作為大類成分間接控制的一個指標，總黃酮的權(quán)重系數(shù)定為0.3。

2.2.1 溶媒:取2份等量藥材，分別加入10倍量水和10倍量70%乙醇，各提取1次，1h/次。將提取液過濾，濃縮并定容，得供試品液。按評價指標測定方法分別測定綠原酸、總黃酮、牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。

表1 藥材提取效率

由表1可見，醇提液比水提液的有效成分得率高，且水的極性大，易提取出果膠、黏液質(zhì)、色素等多種雜質(zhì)，使得提取液難于過濾、易于霉變、不易儲藏，故選擇乙醇為提取溶劑。

2.2.2 乙醇濃度:取5份等量藥材，分別加入10倍量的50、60、70、80、90(%)乙醇，各浸泡2h，提取1 次，1h/次。將提取液過濾、濃縮后定容，得供試品液。按前述方法分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。

從圖1中可看出，70%的乙醇對綠原酸和牛蒡子苷都有較好的提取效果，而60%的乙醇則更適宜黃酮類化合物的提取。通過對3個有效成分的得率進行綜合評價，選取70%乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 料液比:取 5 份等量藥材，分別加入 6、8、10、12、14倍的70%的乙醇，各浸泡2h，提取1次，1h/次。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，按前述方法分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。

一般來說，溶媒用量越大，越利于有效成分的提取，隨著料液比的增大，有效成分得率也在增加。從圖2可看出，當料液比達到1:12后，綠原酸、牛蒡子苷得率隨料液比的變化不大，說明溶劑已將有效成分基本溶出完全;當料液比為1:8時，最有利于總黃酮的提取。綜合各料液比對有效成分得率的影響，從節(jié)約角度出發(fā)，選取料液比為1:10來進行實驗。

圖1 乙醇濃度對提取的影響

圖2 藥材與溶劑比對提取的影響

2.2.4 提取時間:取6份等量的藥材，分別用10倍量70%乙醇浸泡 2h，提取 1 次，分別提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3(h)。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。結(jié)果見圖3。

提取時間過短不利于有效成分的浸出，但時間過長又會使大量雜質(zhì)成分溶出，且有效成分的活性受到破壞，得不償失，因此要控制好提取時間。由圖3可以看出，隨著提取時間的延長，有效成分得率提高。但時間增長到1.5h總黃酮和牛蒡子苷得率達到最大值，繼續(xù)延長提取時間后，總黃酮和牛蒡子苷得率反而降低，說明提取時間過長會破壞有效成分，因此提取時間控制在1.5h左右即可。

圖3 提取時間對提取率的影響

圖4 浸泡時間對提取率的影響

2.2.5 提取次數(shù):取3份等量藥材，各用10倍量70%的乙醇浸泡2h，分別提取1次、2次、3次，1h/次。將提取液過濾、濃縮、定容，得供試品液，測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。結(jié)果見表2。

表2 提取次數(shù)對提取效果的影響(n=3)

由表2可見，有效成分的得率隨著提取次數(shù)的增加而增加。多次提取較一次提取可提高有效成分的浸出率，但不適當?shù)卦黾犹崛〈螖?shù)會增加生產(chǎn)能耗，造成浪費，一般提取次數(shù)不超過3次為宜。

2.2.6 浸泡時間:取4份等量藥材，分別用10倍量70%的乙醇浸泡 0、1、2、2、3(h)，各提取 1 次，1h/次。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計算有效成分得率。

中藥飲片多數(shù)是干燥狀態(tài)，在正式提取前予以適當?shù)慕荩苁癸嬈杖苊?，使組織浸潤膨脹，有利于提取過程中溶質(zhì)的加速溶解和擴散。提取時大多數(shù)情況下溫度較高，如果中藥材原料直接與熱溶媒接觸，會使表面的蛋白質(zhì)層受熱凝固，妨礙后續(xù)溶劑對細胞組織的滲透浸潤，因此先用溶媒浸泡待提取原料后再進行提取，能夠避免這一弊端。

從圖4可看出，浸泡后有效成分的得率明顯高于不浸泡而直接提取時有效成分的得率，浸泡時間達2h，綠原酸和牛蒡子苷浸出效果較好，綜合3個有效成分得率大小，選擇在提取前先浸泡2h。

3 結(jié)論

本文選取了溶媒、醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)和浸泡時間等6個單因素考察了清喉顆粒的提取工藝。實驗結(jié)果表明:乙醇對有效成分的提取效果優(yōu)于水的效果;70%的乙醇更適于有效成分的提取;從節(jié)約原料的角度出發(fā)，綜合料液比對3種有效成分的影響大小，確定了料液比為1:10;由于長時間的煎煮會對造成有效成分的損失，選擇提取時間為1.5h;浸泡2h再進行復方的提取效果更佳。

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