煙草煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠氣道CCR6 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

韓小花，杜永成，張新日，李 毅

(1.山西省人民醫(yī)院呼吸科，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，太原 030001)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。吸煙與哮喘關(guān)系密切，長期吸煙可增加哮喘發(fā)作的嚴(yán)重度和病死率。吸煙可改變哮喘患者氣道炎癥的特點(diǎn)，導(dǎo)致哮喘患者激素治療效果更差，肺功能下降更快。免疫-炎癥機(jī)制是近幾年支氣管哮喘研究的熱點(diǎn)，趨化因子的作用亦受到了廣泛關(guān)注。CCR6是趨化因子CCL20唯一的受體，Lukacs NW［1］和 Bracke KR［2］等人的研究表明CCR6不僅在哮喘氣道粘膜免疫中的作用非常重要，而且對(duì)于煙草煙霧暴露導(dǎo)致的肺部炎癥具有重要作用。本文通過觀察煙草煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探究吸煙哮喘氣道炎癥發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制，以期為臨床治療哮喘尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

6～8周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠〔山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào) SXCK(晉)2009-0001〕40只，平均體重(200±20)g。卵白蛋白(OVA)購自美國 Sigma公司，實(shí)驗(yàn)用香煙為湖南中煙工業(yè)公司生產(chǎn)的芙蓉牌過濾嘴香煙 (煙堿1.0 mg/支，焦油12.0 mg/支)。兔抗大鼠 CCR6多克隆抗體試劑盒及SABC(兔IgG)試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司;MIAS-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)為四川川大智勝軟件股份有限公司產(chǎn)品。第一鏈cDNA合成試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit K1622)為加拿大Permentas公司產(chǎn)品;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(Roche LightCycler1.0)為瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制備:40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:對(duì)照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘+煙霧暴露組，每組10只。參照文獻(xiàn)制備哮喘模型［3］:于第 1天和第8天以 10%OVA 1 mL、氫氧化鋁100 mg腹腔注射致敏，第14天后置于透明密閉容器中給予1%OVA溶液60 mL霧化吸入激發(fā)，中等霧量，1次/d，每次30 min，每周5次，以大鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功，連續(xù)激發(fā)8周。對(duì)照組:以生理鹽水代替 OVA腹腔注射，第14天后給予生理鹽水霧化(60 mL)8周。參照許三林等［4］自制實(shí)驗(yàn)性大鼠被動(dòng)吸煙裝置，吸煙室大小(100×80×60)cm。煙霧暴露組:前期制備同對(duì)照組，生理鹽水霧化30 min后給予大鼠被動(dòng)吸煙1次，每次吸煙10支，大約1 h，每周吸煙5 d，共吸煙8周。哮喘 +煙霧暴露組:前期制備同哮喘組，從吸入1%OVA開始，每日于霧化激發(fā)30 min后，給予被動(dòng)吸煙，共8周，吸煙方法和時(shí)間同煙霧暴露組。

1.2.2 標(biāo)本采集:末次霧化激發(fā)24 h內(nèi)，25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，行支氣管肺泡灌洗，暴露氣管進(jìn)行插管，3 mL PBS液反復(fù)沖洗3遍，回收的灌洗液離心(1 500 r/min)留取重懸細(xì)胞沉淀，行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)涂片用于HE染色進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。留取右肺組織，放入DEPC處理過的凍存管中－80℃冰箱中凍存，用于 RT-PCR法檢測。左肺以中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學(xué)染色、蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.3 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類:大鼠支氣管肺泡灌洗液行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、HE染色及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.2.4 Rear-time PCR檢測大鼠肺組織CCR6 mRNA的表達(dá)水平:引物由上海生工生物科技有限公司合成。CCR6引物序列:(上游引物)5'-AACATGGTCCTCCTCGTGAC-3'，(下 游 引 物)5'-TACAACACGGGGTTGAGACA-3'，擴(kuò)增片段大小:137 bp;設(shè)β-actin做內(nèi)參照物。取－80℃保存的肺組織，提取總 RNA，再合成第一鏈 cDNA，置 －20℃冰箱備用。采用SYBR green熒光染料法反應(yīng)45個(gè)循環(huán)，整個(gè)過程收集熒光，使各組內(nèi)每樣本與內(nèi)參擴(kuò)增效率相同，采用 2－ΔΔCt法［5］計(jì)算樣本的原始拷貝數(shù)，分別擴(kuò)增 CCR6 mRNA和 β-actin。利用相應(yīng)軟件獲得各組樣本與內(nèi)參β-actin相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，讀取樣本 Ct(cycle threshold)值(即在 PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))，計(jì)算ΔCt值(各樣本測定基因與內(nèi)參基因 Ct值的差值)和 ΔΔCt值(其余樣品的ΔCt值和對(duì)照樣本相應(yīng)基因的 ΔCt值之差)，最終得出2－ΔΔCt值(相對(duì)于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù))以獲得四組間CCR6mRNA的相對(duì)定量比較，即以正常對(duì)照組為參照，其余各組CCR6mRNA相對(duì)表達(dá)量用參照組的 2－ΔΔCt倍表示。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠氣道CCR6蛋白的表達(dá):石蠟切片厚4 μm，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SABC)測定。按照 SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作，CCR6一抗稀釋濃度為1:100，陽性表達(dá)為支氣管上皮細(xì)胞胞膜和胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。切片結(jié)果均采用MIAS-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測每支細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的平均光密度(A值)，取5支完整細(xì)支氣管的平均值代表該切片CCR6蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變

肺組織HE染色:對(duì)照組肺泡及細(xì)支氣管形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛排列整齊，管腔規(guī)則，僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，基底膜較薄;煙霧暴露組支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞脫落或變性，氣道壁增厚，氣道壁和肺組織可見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;哮喘組氣道壁和肺組織可見淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，黏膜皺褶增多，部分支氣管上皮壞死、脫落，氣道壁增厚，管腔狹窄;哮喘+煙霧暴露組肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡間隔變薄或斷裂，氣道壁明顯增厚，大量淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(圖1～4見彩插3)。

2.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

哮喘組、哮喘 +煙霧暴露組 BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞較對(duì)照組、煙霧暴露組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P ＜0.05);哮喘+煙霧暴露組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞較哮喘組增加，嗜酸粒細(xì)胞較哮喘組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠肺組織CCR6基因表達(dá)的檢測結(jié)果

利用相應(yīng)軟件分別獲得各組樣本與內(nèi)參 βactin相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線(圖5～6見彩插3)以對(duì)照組為定標(biāo)，分別計(jì)算得對(duì)照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘+煙霧暴露組的Ct值、△Ct值和△△Ct值，最后算出 2－ΔΔCt值(表 1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析哮喘組、哮喘+煙霧暴露組的CCR6mRNA水平均高于對(duì)照組、煙霧暴露組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.01);哮喘+煙霧暴露組的轉(zhuǎn)錄水平高于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

表1各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.01;與哮喘組比較，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.01，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

組別Groups 白細(xì)胞總數(shù)WBC(×107/L)嗜酸粒細(xì)胞EOS(%)中性粒細(xì)胞NEU(%)淋巴細(xì)胞LYM(%)巨噬細(xì)胞AM(%)對(duì)照組Control group 10.1±3.8 1.3±0.7 2.2±1.1 6.3±1 value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01.8 89.6±2.7煙霧暴露組 Smoke exposure group 47.7±6.8a 0.5±0.3 2.7±1.4 6.6±2.0 90.5±5.4哮喘組OVA exposure group 69.0±3.5b 4.1±1.0a 8.9±2.0a 21.4±3.7a 65.6±3.8a哮喘+暴露組OVA combined smoke 86.7±5.2bc 2.2±1.0ac 19.0±2.8ac 23.8±3.8a 55.2±2.9ac F value 349.1 29.7 129.1 78.4 166.8 P

2.4 各組大鼠氣道CCR6蛋白的表達(dá)結(jié)果

CCR6主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿中，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。正常對(duì)照組，CCR6不表達(dá)或僅有弱陽性表達(dá);哮喘組和哮喘+煙霧暴露組的CCR6蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組、煙霧暴露組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.01);哮喘 +煙霧暴露組高于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖7～10見彩插4)。各組大鼠氣道 CCR6蛋白表達(dá)結(jié)果的比較見表2。

表2 各組大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

表2 各組大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.001;與哮喘組比較，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.001，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

CCR6 A value對(duì)照組組別Groups CCR6 mRNA(2 －ΔΔCtvalue)value ＜0.01 ＜0.01 Control group 1.01±0.52 0.299±0.027煙霧暴露組Smoke exposure group 5.55±0.54a 0.442±0.018a哮喘組 OVA exposure group 8.15±0.88b 0.452±0.013b哮喘+暴露組OVA+smoke 15.16±0.87bc 0.531±0.024bc F value 538.15 163.63 P

3 討論

研究表明煙草煙霧能增加OVA致敏豚鼠氣道急性變應(yīng)性炎癥反應(yīng)［6］，吸煙哮喘氣道炎癥的特點(diǎn)是Th2細(xì)胞反應(yīng)加強(qiáng)［7］、氣道壁以中性粒細(xì)胞浸潤為主［8］，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)а等炎性細(xì)胞因子水平增加［9］，但其機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)，煙霧暴露組采用小量吸煙，BALF中性粒細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加，但所占細(xì)胞比例無明顯變化，表明小量吸煙對(duì)BALF細(xì)胞分類影響不大。但哮喘大鼠煙霧暴露后BALF白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例明顯增加，嗜酸粒細(xì)胞減少，氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤更加明顯，進(jìn)一步證實(shí)煙霧暴露可以加重和改變哮喘氣道原有的炎癥反應(yīng)。

趨化因子(chemokine)是一類結(jié)構(gòu)相似、分子量8～10 kD、具有趨化功能的細(xì)胞因子的總稱。趨化因子通過趨化多種炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，在多種疾病的免疫反應(yīng)及炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用。近年來，趨化因子在哮喘氣道炎癥中的作用受到了廣泛關(guān)注。

趨化因子CCL20是β趨化因子家族的新成員，又稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)，CCR6是CCL20唯一的受體。Lukacs NW 等［1］用 CCR6基因敲除哮喘模型小鼠(CCR6－/－)與野生型小鼠對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，CCR6－/－小鼠支氣管嗜酸粒細(xì)胞聚集數(shù)量較野生型小鼠降低了10倍，IL-5水平降低了5～8倍，氣道阻力降低了2～3倍，同時(shí)血漿中IgE水平亦顯著降低。同樣，由 Leborgne等［10］作者也發(fā)現(xiàn):由CD8+T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)招募樹突狀細(xì)胞到上皮組織依賴于CCR6/MIP-3α途徑。以上研究表明，氣道上皮CCR6表達(dá)水平在哮喘的氣道慢性炎癥中起著非常重要的作用。而Bracke KR等［2］研究中發(fā)現(xiàn)，煙霧暴露的CCR6－/－小鼠肺組織MIP-3α mRNA及其蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低;肺泡灌洗液中樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少;TNF-a基因表達(dá)水平較對(duì)照組也顯著降低。該研究表明，CCR6表達(dá)水平對(duì)于煙草煙霧暴露導(dǎo)致的肺部炎癥也具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)過敏性炎癥時(shí)氣道上皮細(xì)胞可分泌大量 CCL20［11］，而 CCR6是 CCL20 唯一的受體，本實(shí)驗(yàn)研究了煙霧暴露對(duì)哮喘大鼠氣道上皮CCR6表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘+煙霧暴露組大鼠氣道上皮CCR6 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組、煙霧暴露組和哮喘組均顯著增高，BALF及氣道周圍炎癥細(xì)胞明顯增加，表明煙草煙霧暴露可通過增加哮喘大鼠氣道粘膜CCR6表達(dá)水平，促進(jìn)氣道慢性炎癥反應(yīng)。研究表明CCL20表達(dá)水平能夠被TNF-a等許多前炎性細(xì)胞因子和空氣微粒上調(diào)［12］，吸煙能夠使 TNF-a 等炎性細(xì)胞因子水平增加［2，9］，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測煙草煙霧暴露可直接或通過TNF-a等炎癥因子的釋放間接作用于氣道上皮細(xì)胞，使其產(chǎn)生大量CCL20，后者與其受體CCR6相互作用，選擇性地招募樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞并使其活化，從而產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧自由基和蛋白酶等，進(jìn)一步加重了哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)。

總之，哮喘氣道慢性炎癥是多種因素綜合作用的結(jié)果，發(fā)生機(jī)理非常復(fù)雜，煙草煙霧暴露可以加重和改變哮喘氣道原有的炎癥反應(yīng)，CCR6在其發(fā)生發(fā)展過程中有一定作用，但其具體機(jī)制尚未完全明了，有待進(jìn)一步研究。

［1］ Lukacs NW，Prosser DM，Wiekowski M，et al．Requirement for the chemokine receptor CCR6 in allergic pulmonary inflammation［J］．J Exp Med，2001，194(4):551－555．

［2］ Bracke KR，D'hulst AI，Maes T，et al．Cigarette smoke-induced pulmonary inflammation and emphysema are attenuated in CCR6 deficient mice［J］．J Immunol，2006，177(7):4350 － 4359．

［3］ 沈華浩，王蘋莉．支氣管哮喘小鼠模型應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28:284－286．

［4］ 許三林，吳人亮，陳春蓮，等．上皮鈣粘附素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22:417－419．

［5］ Kenneth J，Livak TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－ΔΔCtmethod ［J］．Method，2001，25(9):402－408．

［6］ Van Hove CL，Moedoose K，Maes T，et al．Cigarette smoke enhances Th-2 driven airway inflammation and delays inhalational tolerance［J］．Respir Res，2008，9:42．

［7］ Nouri-Shirazi M，Guinet E．A possible mechanism linking cigarette smoke to higher incidence of respiratory infection and asthma［J］．Immunol Lett，2006，103(2):167 －176．

［8］ Chalmers GW，Macleod KJ，Thomson L，et al．Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma ［J］．Chest，2001，120(6):1917 －1922．

［9］ Tamimi A，Serdarevic D，Hanania NA．The effects of cigarette smoke on airway inflammation in asthma and COPD:therapeutic implications［J］．Respir Med，2012，106(3):319 －328．

［10］ Le Borgne MN，Etchart A，Goubier SA，et al．Dendritic cells rapidly recruited into epithelial tissues via CCR6/CCL20 are responsible for CD8+T cell crosspriming in vivo［J］．Immunity，2006，24:191－201．

［11］ Ghadjar P，Rubie C，Aebersold DM，et al．The chemokine CCL20 and its receptor CCR6 in human malignancy with focus on colorectal cancer［J］．Int J Cancer，2009，125(4):741 －745．

［12］ Reibman J，Hsu Y，Chen LC，et al．Airway epithelial cells release MIP-3α/CCL20 in response to cytokines and ambient particulate matter［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2003，28(6):648－654．