雷竹林存留有機(jī)覆蓋物高效降解菌株分離及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

可 曉，陳雙林，張小平，郭子武

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽，311400；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，四川 雅安 625014)

雷竹Phyllostachys violascens林地有機(jī)材料(主要為礱糠、稻草、鋸木屑等)覆蓋竹筍早出技術(shù)的推廣應(yīng)用始于20世紀(jì)90年代初，滿足了市場(chǎng)供應(yīng)淡季對(duì)鮮筍的大量需求，顯著地提高了筍用竹林的經(jīng)濟(jì)效益[1]。然而，長(zhǎng)期連年覆蓋會(huì)導(dǎo)致雷竹林地土壤理化性質(zhì)劣變，竹林地上和地下部分結(jié)構(gòu)失衡[2－6]，致使雷竹林大面積衰敗，如雷竹筍用竹主產(chǎn)區(qū)浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)超過1萬hm2雷竹林中重度、中度、輕度退化竹林所占比例分別達(dá)13.34%，26.66%和46.67%，未退化竹林僅占13.33%，重度退化竹林幾乎無經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出[7]。而存留于雷竹林土壤中短期內(nèi)難以自然腐解且高碳氮比 (C/N)，富含纖維素和木質(zhì)素的有機(jī)覆蓋物，是導(dǎo)致林地土壤發(fā)生物理、化學(xué)和生物性劣變重要原因之一。因此，從維護(hù)林地覆蓋筍用竹林高效可持續(xù)經(jīng)營(yíng)目標(biāo)出發(fā)，必須采取高效、無二次污染的林地存留有機(jī)覆蓋物促腐措施。目前，具有生物質(zhì)材料降解活性的微生物已廣泛應(yīng)用于高碳氮比材料的工業(yè)發(fā)酵(替代能源的生產(chǎn))[8]、飼料生產(chǎn)[9]和秸稈還田土壤培肥[10]等方面，而對(duì)于筍用竹林存留有機(jī)覆蓋物降解微生物篩選、降解活性及產(chǎn)酶條件的相關(guān)研究尚未見有報(bào)道。本研究從長(zhǎng)期堆放有機(jī)覆蓋物場(chǎng)所的不同腐解程度的稻草、礱糠及覆蓋雷竹林土壤中篩選培養(yǎng)具有高纖維素降解酶活性的微生物，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為筍用竹林林地存留有機(jī)覆蓋物高效促腐制劑的研制提供前期理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料采自浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)(30°24′N，119°32′E)雷竹林林地覆蓋的不同腐解程度的礱糠、稻草及覆蓋雷竹林土壤。礱糠、稻草采用多點(diǎn)取樣法，取混合樣品200.00 g，土壤采用五點(diǎn)取樣法，取0～10 cm土壤混合樣品500.00 g。樣品采集后放入無菌袋內(nèi)，置于冰壺中帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

對(duì)照菌株哈茨木霉(HC)Trichoderma harzianum，綠色木霉(LS)Trichoderma viride購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(赫奇遜濾紙液體培養(yǎng)基):1 cm×6 cm新華定量濾紙、磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.00 g，氯化鈉(NaCl) 0.10 g，硫酸錳(MgSO4°7H2O) 0.30 g，硝酸鈉(NaNO3) 2.50 g，氯化鐵(FeCl3) 0.01 g，氯化鈣(CaCl2) 0.10 g。水 1 000 mL，pH 7.2[11]。

初篩培養(yǎng)基(剛果紅羧甲基纖維素平板培養(yǎng)基):羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.00 g，剛果紅0.40 g，硫酸銨[(NH4)2SO4]2.00 g，硫酸錳(MgSO4°7H2O) 0.50 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.00 g，氯化鈉(NaCl)0.50 g，瓊脂20.00 g。水1 000 mL，自然pH值(不進(jìn)行人為的調(diào)節(jié))[12]。

復(fù)篩培養(yǎng)基(赫奇遜秸稈液體培養(yǎng)基):用稻草取代富集培養(yǎng)基中的濾紙。

1.3 菌株篩選

分別取腐爛的礱糠、稻草及雷竹林土壤樣品各10.00 g，加入裝有90.0 mL無菌水和玻璃珠的150.0 mL三角瓶中，180 r°min－1振蕩30 min使樣品充分分散，取懸濁液5.0 mL接種于45.0 mL富集培養(yǎng)基中，28℃下120 r°min－1振蕩培養(yǎng)2 d。再取培養(yǎng)液接種到新鮮無菌富集培養(yǎng)基中，反復(fù)培養(yǎng)3次。

取第3次富集培養(yǎng)液100 μL均勻涂布在剛果紅羧甲基纖維素平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)，挑取水解圈出現(xiàn)時(shí)間早，水解圈直徑與菌落直徑之比大的菌株進(jìn)行純化并保存。將初篩獲得的菌株分別在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)(真菌)、高氏一號(hào)(放線菌)培養(yǎng)基上活化，用直徑1 cm打孔器在菌落生長(zhǎng)均勻處取菌塊接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，28℃下120 r°min－1振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定發(fā)酵液中濾紙酶活力，篩選具有高纖維素酶活性的菌株。

1.4 濾紙酶(filter paper activity，F(xiàn)PA)活力測(cè)定

濾紙酶活力測(cè)定采用 3，5-二硝基水楊酸顯色法[13－16]。發(fā)酵液于 10 kg°min－1離心 10 min，取上清液即為粗酶液。將新華定量濾紙裁剪成1 cm×6 cm的小條，放入25.0 mL刻度試管中，加入1.0 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)和稀釋酶液0.5 mL，50℃水浴中反應(yīng)1 h，加入3.0 mL 3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑沸水浴5 min，定容到25.0 mL后測(cè)定540 nm波長(zhǎng)吸光度，計(jì)算還原糖量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖量，以酶解反應(yīng)液中還原糖量與發(fā)酵液中還原糖量之差計(jì)算酶活力。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。以1 h 1.0 mL原酶液催化底物(濾紙)轉(zhuǎn)化為1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位(16.67 nkat)。

1.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用赫奇遜液體培養(yǎng)基。選擇不同培養(yǎng)時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7 d)，pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，培養(yǎng)溫度(20，25，30，35，40℃)，碳源[淀粉、 葡萄糖、 微晶纖維素粉、稻草秸稈粉、淀粉和微晶纖維素粉(m∶m=1∶1)和葡萄糖和微晶纖維素粉(m∶m=1∶1)]，氮源(酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和尿素為氮源)及無機(jī)鹽(氯化鐵為0.01g°L－1，氯化鈣0.10 g°L－1，磷酸二氫鉀 1.00 g°L－1，硫酸錳 0.30 g°L－1和氯化鈉 0.10 g°L－1)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別確定目標(biāo)菌株的最佳產(chǎn)酶條件。

1.5.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)以上的各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)菌株產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[L9(34)]，確定目標(biāo)菌株最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)覆蓋物高效降解菌株篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)，從常年堆積的不同腐解程度的礱糠、稻草及覆蓋雷竹林土壤中初步篩選獲得38株在剛果紅羧甲基纖維素平板上能夠產(chǎn)生透明水解圈的菌株，再經(jīng)反復(fù)篩選出透明水解圈出現(xiàn)時(shí)間早，水解圈直徑與菌落直徑比值(HC值)較大的菌株7株(表1)，其中，真菌4株(分別編號(hào)為1.1，2.1，YQ1和YQ9)，放線菌3株(分別編號(hào)為1.2，2.2和3.1)。

表1 菌株培養(yǎng)3 d透明水解圈與菌落直徑比值Table 1 HC values of 9 strains after 3 days cultivation

培養(yǎng)5 d后，從7個(gè)菌株濾紙酶活性分析表明:真菌1.1，2.1，YQ1酶活力極顯著地高于放線菌、真菌YQ9及對(duì)照菌株哈茨木霉(3.93×16.67 nkat)與綠色木霉(4.64×16.67 nkat)，且以2.1菌株的濾紙酶活力最高，達(dá)10.80×16.67 nkat(圖1)，確定菌株2.1為高效目標(biāo)菌株。

2.2 菌株2.1生物學(xué)特性

從菌株2.1的菌落培養(yǎng)特征(表2)及顯微結(jié)構(gòu)特征(圖2a)表明，菌株2.1分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝雙輪生，偶有3輪生或單輪生；梗基每輪2～3個(gè)，13.0～20.0 μm×3.2～3.7 μm，彼此通常較緊貼；瓶梗幼齡時(shí)呈現(xiàn)瓶狀至披針狀，充分成熟時(shí)近圓柱形，梗頸明顯，分生孢子橢圓形，4.5～5.5 μm×3.0～4.0 μm，壁平滑。依據(jù)2.1菌落形態(tài)(圖2b)及菌株顯微結(jié)構(gòu)特征，查《中國(guó)真菌志》(青霉及其相關(guān)有性型屬)[17]、《真菌的形態(tài)和分類》[18]等相關(guān)資料可確定菌株2.1屬青霉屬Penicillium。

2.3 菌株2.1培養(yǎng)時(shí)間、起始酸堿度(pH值)和溫度條件優(yōu)化

圖1 分離菌株的濾紙酶活力Figure 1 Filter paper activity of 9 strains

圖2 菌株2.1的菌落形態(tài)(a)及顯微結(jié)構(gòu)(b)Figure 2 Colony morphology and microstructure of Strain 2.1

表2 菌株2.1菌落形態(tài)特征Table 2 The colony morphology of strain 2.1

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間 培養(yǎng)初期菌株2.1發(fā)酵液濾紙酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢升高，第1，2天發(fā)酵液濾紙酶活力分別為2.72×16.67 nkat，3.32×16.67 nkat，增幅僅為22.51%。第3天酶活力迅速提高，4.95×16.67 nkat，較第2天增加了49.01%。第3天以后，酶活力增加趨勢(shì)減緩，至第5天時(shí)發(fā)酵液酶活力達(dá)峰值(5.62×16.67 nkat)，其后酶活力雖能維持在較高水平，但較第5天有所下降(圖3a)。說明菌株2.1產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

2.3.2 起始酸堿度(pH值) 菌株2.1發(fā)酵液濾紙酶活力隨起始酸堿度(pH值)的變化呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖3b)。起始酸堿度為pH 3.0～5.0時(shí)，菌株酶活力緩慢上升，且較為平穩(wěn)，當(dāng)起始酸堿度為pH 5.0時(shí)，發(fā)酵液濾紙酶活力達(dá)到峰值(4.90×16.67 nkat)，其后隨酸堿度(pH值)的升高酶活力緩慢降低，當(dāng)起始酸堿度超過pH 8.0時(shí)，酶活力開始迅速下降，至起始酸堿度為pH 10.0時(shí)，發(fā)酵液濾紙酶活力僅為2.22×16.67 nkat，為峰值的45.31%。說明菌株2.1培養(yǎng)的最佳起始酸堿度為pH 5.0。

2.3.3 培養(yǎng)溫度 隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株2.1產(chǎn)酶能力呈先升高后降低的變化規(guī)律(圖3c)。在25～30℃區(qū)間內(nèi)酶活力急劇升高，由2.36×16.67 nkat提高到3.67×16.67 nkat，增幅達(dá)55.51%，而后酶活力趨于平穩(wěn)，當(dāng)溫度35℃時(shí)，酶活力為3.83×16.67 nkat，其后酶活力略有降低，40℃時(shí)酶活力下降為3.68×16.67 nkat。雖然35和40℃時(shí)菌株2.1的酶活力均高于30℃的酶活力，但結(jié)合菌株培養(yǎng)及竹林生產(chǎn)實(shí)踐，確定30℃為菌株2.1的最佳培養(yǎng)溫度。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間(a)，起始pH值(b)和培養(yǎng)溫度(c)對(duì)菌株2.1濾紙酶活力的影響Figure 3 Effect of time，pH and temperature on FPA of Strain 2.1

2.4 培養(yǎng)基組合優(yōu)化

2.4.1 碳源 菌株2.1在不同碳源的培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)，但在不同碳源條件下酶活力存在較大差異(圖4a)。以葡萄糖、淀粉、纖維素為單一碳源時(shí)，發(fā)酵液濾紙酶活力分別為1.67×16.67 nkat，1.98×16.67 nkat和1.35×16.67 nkat。當(dāng)用葡萄糖和纖維素(m∶m＝1∶1)共同作為碳源時(shí)，發(fā)酵液濾紙酶活力達(dá)到3.08×16.67 nkat，分別比葡萄糖或纖維素作單一碳源時(shí)增加了84.43%和128.15%。淀粉與纖維素(m∶m＝1∶1)共同作為碳源時(shí)，發(fā)酵液濾紙酶活力僅為0.56×16.67 nkat，遠(yuǎn)低于任一單一碳源的處理。在供試碳源中，以稻草秸稈粉做碳源時(shí)發(fā)酵液中濾紙酶活力最高(5.03×16.67 nkat)。

2.4.2 氮源 菌株2.1在多種氮源條件下均能正常生長(zhǎng)，在有機(jī)氮源條件下發(fā)酵液濾紙酶活力均遠(yuǎn)高于無機(jī)氮源(圖4b)。其中，牛肉膏為氮源時(shí)菌株發(fā)酵液濾紙酶活力最高(5.95×16.67 nkat)，其次是酵母粉(5.19×16.67 nkat)，蛋白胨為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活(4.59×16.67 nkat)略低于牛肉膏和酵母粉為氮源的處理。以硫酸銨和尿素為氮源時(shí)酶活力較低，分別為3.13×16.67 nkat和3.18×16.67 nkat，僅為牛肉膏為氮源時(shí)的52.60%和53.44%。

圖4 碳源(a)，氮源(b)和無機(jī)鹽(c)對(duì)菌株2.1酶活力的影響Figure 4 Effect of C (a)，N (b) source and inorganic salt(c) on FPA of Strain 2.1

2.4.3 無機(jī)鹽 菌株2.1發(fā)酵液濾紙酶活力以培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀(KH2PO4)的最高(5.40×16.67 nkat)，其次是添加氯化鐵(FeCl3)的處理(5.19×16.67 nkat)。這2種無機(jī)鹽處理均遠(yuǎn)高于添加氯化鈣(CaCl2)，氯化鈉(NaCl)和硫酸錳(MgSO4)的處理(分別為 2.98 × 16.67 nkat，2.13 × 16.67 nkat和 1.26×16.67 nkat，僅為最高酶活力的55.18%，39.44%和22.78%)(圖4c)。說明磷酸二氫鉀與氯化鐵對(duì)菌株2.1的酶活力影響較大。

2.4.4 培養(yǎng)基最佳組合 從表3的菌株2.1培養(yǎng)基碳源(稻草秸稈)、氮源(牛肉膏)及無機(jī)鹽(FeCl3)，磷酸二氫鉀添加量正交實(shí)驗(yàn)分析表明，9號(hào)培養(yǎng)基配方的菌株酶活力最高(11.19×16.67 nkat)。稻草秸稈和牛肉膏對(duì)菌株酶活力影響較大，極值分別為5.69和1.00，氯化鐵和磷酸二氫鉀對(duì)菌株酶活力影響較小，極值分別為0.41和0.27。稻草秸稈、牛肉膏、氯化鐵、磷酸二氫鉀均值最大水平分別為A3，B3，C1，D2。經(jīng)方差分析，各因素對(duì)菌株2.1濾紙酶活力影響均達(dá)極顯著水平。表明菌株2.1產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基組合為A3B3C1D2，即秸稈 25.00 g°L－1，牛肉膏 2.50 g°L－1，氯化鐵 0.01 g°L－1，磷酸二氫鉀 1.50 g°L－1。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及培養(yǎng)基組合菌株2.1酶活力Table 3 Design and results of L9(34) experiment and FPA of Strain 2.1

3 結(jié)論與討論

本研究通過稀釋涂平板法和富集培養(yǎng)法，從雷竹林地覆蓋材料礱糠、稻草及覆蓋雷竹林土壤中初步篩選得到了38個(gè)對(duì)林地有機(jī)覆蓋物具有分解活性的菌株，經(jīng)反復(fù)篩選得7株在剛果紅羧甲基纖維素培養(yǎng)基上水解圈直徑較大，且出現(xiàn)時(shí)間早的菌株(真菌4株，放線菌3株)，其中，菌株1.1，2.1，YQ1在僅有羧甲基纖維素為唯一碳源的剛果紅羧甲基纖維素平板上生長(zhǎng)旺盛，濾紙酶活力較高，而且以菌株2.1酶活力最高，遠(yuǎn)高于對(duì)照的綠色木霉和哈茨木霉。由于濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居 “中等”的纖維性材料，濾紙酶活綜合反映了纖維素酶系統(tǒng)中3類酶的綜合效果[19]。因此，可以推斷菌株2.1可能具有較全面的酶系，將其定為目標(biāo)菌株。經(jīng)菌落培養(yǎng)特征和顯微結(jié)構(gòu)特征觀察，菌株2.1屬青霉屬。

隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株2.1濾紙酶活呈先升高而后降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)5 d后酶活力最高。菌株2.1在起始酸堿度為pH 3.0～5.0范圍內(nèi)濾紙酶活較高，酸堿度超過pH 5.0后濾紙酶活力開始下降，這與普遍認(rèn)為的酸性條件有利于真菌產(chǎn)纖維素酶的結(jié)論一致[16]。浙江省的筍用竹林土壤大多為紅壤或黃紅壤、黃壤，呈酸性[20]，適宜菌株2.1的產(chǎn)酶潛力發(fā)揮。溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響，菌株2.1在30℃左右時(shí)產(chǎn)酶活力較高，而浙江省雷竹主栽區(qū)夏季最高氣溫40℃左右，菌株2.1適合浙江省雷竹林生境，能夠應(yīng)用于竹林存留有機(jī)覆蓋物的生物降解。氮、碳及無機(jī)鹽均為降解菌株生長(zhǎng)的必需養(yǎng)分因子，菌株2.1的最佳氮源為牛肉膏，添加量為2.50 g°L－1，最佳碳源為稻草秸稈，添加量為25.00 g°L－1，對(duì)菌株產(chǎn)酶活性有較大影響的無機(jī)鹽為氯化鐵和磷酸二氫鉀，添加量分別為0.01 g°L－1和1.50 g°L－1。

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