配方施肥對(duì)春季桑葉1-脫氧野尻霉素產(chǎn)量的影響

殷 浩，王 麗，佟萬紅，黃蓋群，危 玲，鄭繼川，劉 剛，4

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000；2.四川省蠶業(yè)科技開發(fā)總公司，四川 南充637000；3.四川省林業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066；4.西南大學(xué) 蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，重慶400716)

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin，DNJ)是一種哌啶類生物堿，一種高效的α-糖苷酶抑制劑，具有顯著的降血糖功效[1－3]。目前，人們所知的天然植物中，桑樹Morus alba中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高[4]，而且作為桑樹的主要產(chǎn)物——桑葉，其DNJ約為10.0 g°kg－1，是降血糖天然藥物開發(fā)的優(yōu)質(zhì)原料。大量學(xué)者對(duì)桑葉中的DNJ進(jìn)行了廣泛的研究[5－11]，但大多僅限于其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而作為植物生長及代謝的重要因素的肥料卻少見相關(guān)報(bào)道，尤其是配方施肥對(duì)桑葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其總產(chǎn)量的影響，迄今尚未見相關(guān)報(bào)道。基于以上設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)初步探討了 “3414”配方施肥對(duì)桑葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量的影響，并進(jìn)一步擬合肥料效應(yīng)函數(shù)，獲得推薦施肥參數(shù)，為建設(shè)DNJ高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)桑園提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器試劑和DNJ的測(cè)定方法

1.1.1 試劑 1-deoxynojirimycin-HCl(DNJ-HCl)為美國 Sigma公司產(chǎn)品；9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC-Cl)為美國Fluca公司產(chǎn)品；乙腈色譜純?yōu)橹袊旖蚴袆P通化學(xué)試劑有限公司出品；其他試劑皆為分析純(中國)；試驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

1.1.2 儀器 Dionex 500E型高效液相色譜儀為美國Dionex公司產(chǎn)品，色譜柱為科瑞Venus-C18-5u，檢測(cè)器為UVD170U紫外檢測(cè)器，分析軟件為Dionex chromeleox工作站； TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(中國)，KQ-600型超聲波清洗器(中國)，電子恒溫水浴鍋(中國)，旋渦混合器(中國)等均。

1.1.3 DNJ的測(cè)定方法 參照KIM等[12]報(bào)道的方法的基本原理，按照Yin等[13]描述的方法測(cè)定。①測(cè)試樣品的提取:稱取待測(cè)桑葉粉30 mg，加入1 mL 0.05 mol°L－1鹽酸 (HCl)，渦流1 min，超聲波處理40 min，12 000 r°min－1離心30 min，收集上清液，沉淀物再按上步重復(fù)抽提1次，合并2次上清液，定容至2 mL，即得樣品提取液。②DNJ的衍生化:取桑葉粉提取液140 μL于1.5 mL的離心管，加入0.40 mol°L－1硼酸鉀緩沖液(pH 8.5)169 μL，再加入 5 mmol°L－1的衍生化試劑 FMOC-Cl(溶解于體積分?jǐn)?shù)為 50%乙腈中)250 μL，混勻，25 ℃恒溫水浴中反應(yīng) 20 min，加入 1.00 mol°L－1的甘氨酸(gly)25 μL 中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，再加體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液66 μL，用水定容至707 μL，最后用孔徑0.2 μm尼龍膜過濾，收集濾液，即得測(cè)試液。③測(cè)定方法:采用反相高效液相層析(RP-HPLC)法測(cè)定，色譜柱為科瑞Venus-C18-5u，檢測(cè)器為UVD170U紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長254 nm，流動(dòng)相為乙腈∶體積分?jǐn)?shù) 0.1%醋酸＝11∶16(體積比)，流速為 1.0 mL°min－1，進(jìn)樣量 20 μL。分析軟件為 Dionex chromeleox工作站，外標(biāo)法分析計(jì)算。所有樣品均測(cè)定3次，平均值為其DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 試驗(yàn)點(diǎn)基本情況

試驗(yàn)于2010年在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所瀠溪科研試驗(yàn)桑園進(jìn)行。該試驗(yàn)地土壤類型為紫色土。2 月測(cè)定 0～20 cm 土層的土壤肥力為: 有機(jī)質(zhì) 33.1 g°kg－1，全氮(N)1.6 g°kg－1，有效磷(P2O5)117.6 mg°kg－1，速效鉀(K2O)164.2 mg°kg－1，土壤 pH 7.72。試驗(yàn)桑園栽植桑樹品種為川 826，樹齡 6 a。桑樹栽植株行距為0.66 m×1.33 m，栽植密度為11 400株°hm－2，各小區(qū)均設(shè)置隔離帶。1月上旬修枝整形，枝條8根°株－1，其他田間管理與常規(guī)管理相同。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用現(xiàn)代肥料二次回歸“3414”試驗(yàn)設(shè)計(jì),在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)氮磷鉀3因素4水平14個(gè)處理(表1)，隨機(jī)排列。設(shè)計(jì)中4個(gè)水平:0水平指不施肥，2水平指當(dāng)?shù)赝扑]施肥量，1水平為2水平 ×0.5，3水平為2水平×1.5(該水平為過量施肥水平)。各種處理為3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)面積為30 m2。在有機(jī)肥6 000 kg°hm－2的基礎(chǔ)上布置各施肥處理,肥料采用尿素(N，460 g°kg－1)，過磷酸鈣(P2O5，120 g°kg－1)，氯化鉀(K2O，600 g°kg－1)，在 2 月下旬施肥。

1.4 調(diào)查方法

1.4.1 肥料對(duì)桑樹不同部位葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 2010年5月20日，查看并標(biāo)記正常發(fā)育，樹形較好的桑樹。各小區(qū)選擇6株桑樹，每株桑樹選擇2條典型桑枝。6月10日在相同部位分別采摘2片嫩芽、嫩葉、成熟葉、老葉，各處理的各小區(qū)的各部位葉分別混合，60℃烘干后，研磨過200目篩，測(cè)定各處理桑樹不同部位葉的DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.2 肥料對(duì)桑葉DNJ產(chǎn)量的影響 各處理實(shí)收測(cè)產(chǎn)調(diào)查，收集各處理所有的桑葉，60℃烘干后推算單位面積桑樹的干桑葉產(chǎn)量。將各處理烘干的桑葉混合均勻，研磨過200目篩，測(cè)定各處理桑葉的DNJ平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。干桑葉產(chǎn)量(kg°hm－2)＝ 平均單株干桑葉質(zhì)量(kg)×750(667 m2桑樹株數(shù)) ×15。桑葉DNJ產(chǎn)量(kg°hm－2)＝ 桑葉干物質(zhì)量(kg°hm－2)× 桑葉 DNJ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g°kg－1)。

表1 “3414”施肥設(shè)計(jì)方案Table 1 “3414” fertilization experiment design

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0和SAS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.1 施氮量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 選取N0P2K2，N1P2K2，N2P2K2和N3P2K2，探討施氮量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響(圖1-A)。結(jié)果表明:在同一處理中，春季上位葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于下位葉:嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉；桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著施氮量的增加而顯著增高，在N2水平時(shí)，嫩芽、嫩葉、成熟葉和老葉DNJ達(dá)到最大，分別為3.988，3.496，2.462和1.671 g°kg－1，隨著施氮量的進(jìn)一步增加，即N3水平，桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，但仍顯著高于N1水平。

2.1.2 施磷量對(duì)桑葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 選取N2P0K2，N2P1K2，N2P2K2，N2P3K2，探討施磷量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響(圖1-B)。結(jié)果表明:在同一處理中春季上位葉DNJ質(zhì)量明顯高于下位葉:嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉。嫩芽和嫩葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相同，P2和P3，P0和P1相互之間桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)均沒有顯著差異，但前者DNJ顯著高于后者，嫩芽和嫩葉中DNJ最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.988 g°kg－1和3.496 g°kg－1。磷肥對(duì)春季成熟葉中DNJ影響較大，隨著施磷量的增加，成熟葉中DNJ也顯著增加，在P2水平時(shí)達(dá)到最大值2.462 g°kg－1，P3水平時(shí)又顯著降低，但仍顯著高于P1水平。隨著施磷量的增加，春季老葉中DNJ也顯著增加，在P2水平時(shí)達(dá)到最大值(1.671 g°kg－1)，P3與P2之間沒有顯著差異。

2.1.3 施鉀量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 選取N2P2K0，N2P2K1，N2P2K2和N2P2K3，探討施鉀量對(duì)桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響(圖1-C)。結(jié)果表明:在同一處理中，春季上位葉中DN質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于下位葉:嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉。嫩芽中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)在K0，K1和K3水平上均沒有顯著差異，但均顯著低于K2水平的嫩芽中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)(3.988 g°kg－1)；嫩葉、成熟葉和老葉中DNJ隨著施鉀量的增加表現(xiàn)相同的變化:K2和K3，K0和K1相互之間均沒有顯著變化，但前者顯著高于后者，DNJ最大值分別為3.496，2.462 和 1.671 g°kg－1。

圖1 施氮量、放磷量和施鉀量對(duì)桑葉DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 1 Effects of nitrogen phosphorus and potassium rate on the DNJ contents of mulberry leaf

2.2 桑葉平衡施肥設(shè)計(jì)肥料效應(yīng)模型的配置

采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，利用當(dāng)年的肥料和 DNJ價(jià)格:氮(N)4.10 元°kg－1，磷(P2O5)3.20 元°kg－1，鉀(K2O)5.00 元°kg－1，DNJ為 2.00 × 108 元°kg－1及表1～2，建立以桑葉總 DNJ產(chǎn)量為函數(shù)，氮磷鉀為因子的肥料效應(yīng)函數(shù)，求算出最佳施肥量及最佳產(chǎn)量。

表2 施肥水平對(duì)桑葉DNJ產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of fertilazation level on the DNJ content of mulberry

2.2.1 三元二次肥料效應(yīng)函數(shù) 桑葉三元二次肥料效應(yīng)函數(shù):y＝11.356 7＋0.063 936 N＋0.041 096 P＋0.009 627 K－0.000 12 N2－0.000 15P2－0.000 075K2－0.000 039NP＋0.000 0529NK－0.000 008 6PK(R＝0.98，P＝0.003 66＜0.05)。由上述全因子模型，求出最佳施肥量及最佳產(chǎn)量。

2.2.2 多種肥料效應(yīng)函數(shù)的施肥決策信息 桑葉中總DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為23.23 kg°hm－2，推薦施肥指標(biāo)氮(N)為 286.1 kg°hm－2，磷(P2O5)為 95.2 kg°hm－2，鉀(K2O)為 159.6 kg°hm－2。

3 討論

氮磷鉀是植物生長的3種基本要素，但不同的植物對(duì)其需要量及其比例是不同的，不同肥力水平的土壤，施用肥料的最佳用量差別很大，尤其是藥用植物，對(duì)其精準(zhǔn)施肥的研究不僅要追求其含量及其產(chǎn)量，還要注重次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。張燕等[14]報(bào)道:單施氮肥對(duì)益母草Leonurus japonicus中水蘇堿和總生物堿有很大的促進(jìn)作用，足量的磷元素與氮元素的合理配飾可以提高氮的肥效。紀(jì)瑛等[15]研究表明:施用氮肥能顯著提高苦參Sophora flavescens中總生物堿的含量及其產(chǎn)量，但過量施用則呈降低趨勢(shì)。陳泉等[16]報(bào)道:施肥并不能顯著影響植物生物堿的含量，只是顯著提高植物干物質(zhì)產(chǎn)量，從而增加了生物堿產(chǎn)量。其他相關(guān)研究結(jié)果也證明氮素對(duì)植物體內(nèi)生物堿含量具有提高和促進(jìn)效應(yīng)[17－19]。肥料對(duì)桑葉中DNJ的質(zhì)量及其產(chǎn)量的影響的相關(guān)研究報(bào)道較少。Yin等[10]報(bào)道了不同氮素形態(tài)及其配比均能顯著影響桑葉中DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)。而本試驗(yàn)結(jié)果表明:氮磷鉀單因素均能顯著影響春季桑葉中DNJ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，不同氮磷鉀施入量及其配比能顯著影響春季桑葉DNJ產(chǎn)量。氮素是DNJ合成的必需元素，所以施氮量對(duì)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其產(chǎn)量的影響較大，而磷鉀元素可能直接或間接影響DNJ的合成；過量施肥，桑葉DNJ不會(huì)提高，甚至?xí)@著降低，這可能是破壞了土壤環(huán)境的養(yǎng)分平衡或DNJ達(dá)到一個(gè)平臺(tái)后表現(xiàn)的飽和反應(yīng)。

本試驗(yàn)利用肥料效應(yīng)函數(shù)得到桑葉DNJ的最佳產(chǎn)量及其最佳施肥指標(biāo)，為以桑葉為主要原料，并以DNJ為主要成分的產(chǎn)品開發(fā)，提供獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原料的施肥方法，為解決人工栽培中存在的藥材質(zhì)量不穩(wěn)定等問題提供參考。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成過程較為復(fù)雜，生物因素和非生物因素均能顯著影響其含量[20]，所以對(duì)它們?nèi)孕柘到y(tǒng)的研究，尤其是影響DNJ生物合成的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

氮磷鉀的施肥水平能顯著影響桑葉中的DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在單因素水平時(shí)，隨著施肥量的增加，桑葉中DNJ也隨之顯著增加，在N2P2K2水平時(shí)達(dá)到最大，再增施肥料，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本沒有變化或者顯著降低，所以科學(xué)施肥能顯著提高桑葉的DNJ產(chǎn)量。通過建立肥料效應(yīng)函數(shù)，得到桑葉的推薦施肥指標(biāo)和DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量:桑葉中總DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為23.23 kg°hm－2，推薦施肥指標(biāo)氮(N)為286.1 kg°hm－2，磷(P2O5)為 95.2 kg°hm－2，鉀(K2O)為 159.6 kg°hm－2。

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