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    犬干擾素α制備工藝的優(yōu)化

    2012-11-23 05:56:32殷玉和李瑩瑩劉新濤吳叢梅
    中國(guó)獸藥雜志 2012年3期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性密碼子層析

    殷玉和,李瑩瑩,劉新濤,吳叢梅

    (長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130012)

    犬干擾素α(CaIFN-α)具有廣譜抗病毒活性,可治療犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱等高致死性病毒病[1]。2009年陳紅英等[2]利用PCR技術(shù)從藏獒犬肝臟基因組DNA中擴(kuò)增了犬干擾素α全基因,并對(duì)該基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。2010年項(xiàng)黎麗等[3]克隆、表達(dá)了 CaIFN-α,目的蛋白表達(dá)量約為20%。目前還沒(méi)有關(guān)于CaIFN-α大規(guī)模生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)性研究報(bào)道。本文對(duì)CaIFN-α序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,并設(shè)計(jì)合成編碼CaIFN-α的基因片段,著重對(duì)CaIFN-α包涵體的破碎,CaIFN-α蛋白的變性、復(fù)性及純化的方法進(jìn)行了研究,從而優(yōu)化CaIFN-α大規(guī)模生產(chǎn)工藝。

    1 材料與方法

    1.1 材料 大腸桿菌E.coli BL21和表達(dá)載體pBV220均為本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ為英國(guó)NEB公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA快速回收試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品;MDCK(犬腎細(xì)胞)、VSV(水皰性口炎)病毒為實(shí)驗(yàn)室保存;AKTA explorer100蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare);發(fā)酵罐(BioFlo5000)。

    1.2 方法

    1.2.1 CaIFN-α基因片段的合成 參照Genbank中CaIFN-α基因序列,使用Codon Usage Database分析大腸桿菌使用密碼子偏好性,在不改變氨基酸序列的前提下,替換了除構(gòu)成mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)密碼子外的利用率低于15%的密碼子,對(duì)密碼子進(jìn)行了優(yōu)化,設(shè)計(jì)EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn),并由上海生物工程有限公司合成,得到優(yōu)化的CaIFN-α基因片段。

    1.2.2 構(gòu)建pBV220-CaIFN-α重組表達(dá)質(zhì)粒將pBV220溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體,用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切,切下表達(dá)載體片段進(jìn)行膠回收,用T4連接酶連接合成的CaIFN-α基因片段與pBV220表達(dá)載體,構(gòu)建 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定,證實(shí)構(gòu)建正確。

    1.2.3 重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21,按1%接種量將E.coli BL21工程菌接種于200 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中,30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物按5%接種量接種于1 L含氨芐青霉素(50 μg/mL)LB培養(yǎng)液中,30℃培養(yǎng)。至 OD600=0.6時(shí),將二代培養(yǎng)物按10%接種量接種于40 L發(fā)酵罐中,30℃培養(yǎng),至OD600=1~2時(shí),快速升溫至42℃,菌體表達(dá),過(guò)程中適量添加補(bǔ)料(30%葡萄糖),控制pH值為7,培養(yǎng)5 h,4000 r/min離心30 min,收集表達(dá)菌體,用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

    1.2.4 CaIFN-α包涵體的制備 將發(fā)酵收集菌體按1∶10懸浮于TE緩沖液中,冰浴條件下超聲破碎30 min(超聲儀頻率20 kHz,超聲5 s,間隔5 s),鏡檢,菌體破碎率90%停止破碎,10000 r/min離心15 min,棄上清,即得CaIFN-α包涵體粗品。

    1.2.5 CaIFN-α包涵體的洗滌、變性及復(fù)性 將CaIFN-α包涵體粗品按1∶5懸浮于4 mol/L尿素(pH=8.5)中,吹打均勻,10000 r/min離心15 min,棄上清,收集沉淀;將沉淀按1∶5溶于7 mol/L鹽酸胍(pH=11)中,混合均勻,裂解作用2~3 h,10000 r/min離心15 min,收集上清,得 CaIFN-α包涵體的溶解液;將包涵體溶解液用2.5 mol/L鹽酸胍(pH=11)按1∶3稀釋后,按1∶8加入到0.15 mol/L硼酸溶液(pH=9.6)中,4℃復(fù)性作用18 h后,得到復(fù)性液。

    1.2.6 CaIFN-α目的蛋白疏水層析 在復(fù)性液中加入(NH4)2SO4至終濃度為1.5 mol/L,上載疏水層析(HIC)柱,柱料為 Phenyl Sepharose 6FF(LS),平衡液為50 mmol/L PB、1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8),洗脫液為 50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8),利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)控制,收集洗脫蛋白樣品。樣品進(jìn)行SDSPAGE純度檢測(cè),Lowry法測(cè)定蛋白濃度,鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素。再生液為0.5 mol/L NaOH,再生色譜柱。

    1.2.7 CaIFN-α目的蛋白分子篩層析 將上述收集樣品上載分子篩層析(Sephacryl-S-100),洗脫液為20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4),利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)控制,收集洗脫蛋白樣品。樣品進(jìn)行SDS-PAGE純度檢測(cè),Lowry法測(cè)定目的蛋白濃度,鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素。再生液為0.1 mol/L NaOH,再生色譜柱。

    1.2.8 CaIFN-α活性測(cè)定 采用細(xì)胞病變抑制法[4-5],依據(jù)抑制 VSV(水皰性口炎)病毒攻擊MDCK(犬腎細(xì)胞)細(xì)胞病變的方法,測(cè)定重組犬干擾素的活性。將MDCK接種于96孔板,5%CO2、37℃培養(yǎng)為單層,加倍比稀釋的重組犬干擾素作用24 h,每孔再加入含100 TCID50的VSV病毒,設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和空白對(duì)照組,24 h后用結(jié)晶紫染液染色細(xì)胞,酶標(biāo)儀上檢測(cè)測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm,參比波長(zhǎng)為630 nm,經(jīng)SOFT max PRO軟件分析輸入稀釋倍數(shù)后,以標(biāo)準(zhǔn)品校正生物活性值。

    1.2.9 制備三批CaIFN-α蛋白 按上述工藝制備三批CaIFN-α蛋白,記錄不同批次CaIFN-α蛋白的質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果

    2.1 CaIFN-α目的基因片段的合成 經(jīng)密碼子優(yōu)化得到的CaIFN-α基因,由上海生物工程有限公司合成。瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察鑒定,結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn),CaIFN-α基因大小約為510 bp,與理論大小相符。

    2.2 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒的酶切鑒定pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切,有明顯的pBV220表達(dá)載體條帶和CaIFN-α基因條帶,說(shuō)明pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,結(jié)果如圖2所示。

    2.3 pBV220-CaIFN-α重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果鑒定 誘導(dǎo)條件:30℃培養(yǎng),升溫42℃誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后每隔1 h取樣1次,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,誘導(dǎo)后在18000處出現(xiàn)明顯CaIFN-α蛋白條帶,說(shuō)明重組質(zhì)粒有表達(dá)。隨誘導(dǎo)時(shí)間增加,CaIFN-α蛋白表達(dá)量增大,誘導(dǎo)5 h CaIFN-α蛋白表達(dá)效果最佳,蛋白表達(dá)量(目的蛋白與總蛋白的百分比)為25%。

    2.4 pBV220-CaIFN-α包涵體破碎、變性及復(fù)性表達(dá)菌體經(jīng)過(guò)超聲破碎得到包涵體,再經(jīng)7 mol/L鹽酸胍變性和0.15 mol/L硼酸復(fù)性作用后,可得到初步純化的CaIFN-α蛋白。復(fù)性后CaIFN-α蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖4所示,在18000處出現(xiàn)明顯CaIFN-α蛋白條帶。

    2.5 CaIFN-α目的蛋白疏水層析 樣品用50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)洗脫液,經(jīng)疏水層析柱純化,圖5為AKTA蛋白純化系統(tǒng)紫外檢測(cè)記錄,洗脫峰為CaIFN-α蛋白峰。圖6為疏水層析純化后樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果,在相對(duì)分子質(zhì)量18000處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶。

    2.6 CaIFN-α目的蛋白分子篩層析 收集的洗脫樣品用20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4)洗脫液,經(jīng)分子篩層析柱純化,圖7為AKTA蛋白純化系統(tǒng)紫外檢測(cè)記錄,洗脫峰為CaIFN-α蛋白峰,純度較高。圖8為分子篩層析純化后樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果,在相對(duì)分子質(zhì)量18000處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶,且?guī)缀鯖](méi)有其他雜蛋白條帶。

    2.7 制備工藝各步驟質(zhì)量檢測(cè) 表1中顯示為包涵體復(fù)性、疏水層析和分子篩層析三個(gè)純化步驟的質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù),總產(chǎn)率為20%。

    2.8 不同批次制備CaIFN-α的質(zhì)量檢測(cè) 如表2所示,制備的三批CaIFN-α質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明,CaIFN-α純度均≥96%,產(chǎn)率均≥20%,內(nèi)毒素均≤10 EU/mg,且都具有較好的生物活性,說(shuō)明本制備工藝穩(wěn)定性好,可重復(fù)性高。

    圖7 分子篩層析的紫外檢測(cè)

    圖8 CaIFN-α純化蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜

    表1 不同純化步驟質(zhì)量檢測(cè)

    表2 不同批次CaIFN-α的質(zhì)量檢測(cè)

    3 討論

    本研究使用Codon Usage Database對(duì)大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行了分析[6-7],在不改變氨基酸序列的前提下,將低利用率的稀有密碼子替換為表達(dá)菌常用的密碼子,對(duì)CaIFN-α基因進(jìn)行了優(yōu)化改造,提高了CaIFN-α基因的表達(dá)水平。選擇將CaIFN-α基因與pBV220溫控型原核高效表達(dá)載體[8]連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21,培養(yǎng)時(shí)間為4 h,升溫誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為5 h,整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)周期較短,且表達(dá)體系具有抗污染能力強(qiáng)的特點(diǎn)[9]。

    由于疏水層析介質(zhì)具有疏水性弱的特點(diǎn)[10],并以高鹽的水溶液作為流動(dòng)相,使得與蛋白質(zhì)的作用過(guò)程比較溫和。CaIFN-α蛋白以包涵體形式存在,具有較強(qiáng)的疏水性,所以本研究選用疏水層析的方法進(jìn)行純化,可以更好保持CaIFN-α蛋白的天然結(jié)構(gòu)和生物活性。疏水層析純化的CaIFN-α樣品上載分子篩層析柱進(jìn)一步純化,可以實(shí)現(xiàn)更替CaIFN-α樣品緩沖液的目的。分子篩層析純化得到的CaIFN-α樣品緩沖液為對(duì)動(dòng)物體無(wú)害的磷酸鹽體系,便于目的CaIFN-α蛋白的進(jìn)一步制劑應(yīng)用。

    采用上述生產(chǎn)工藝制備了三批CaIFN-α蛋白,計(jì)算其總產(chǎn)率均≥20%,目前所報(bào)道的CaIFN-α產(chǎn)率為13.75%[11],與之相比產(chǎn)率有所提高。工藝中采用常規(guī)蛋白質(zhì)色譜分離方法和常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽試劑,使得制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行且更為安全。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明該CaIFN-α生產(chǎn)工藝適合大規(guī)模生產(chǎn),且具有收率高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

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