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    氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    2012-11-23 05:56:28何方洋馮月君岳新榮韓京朋
    中國獸藥雜志 2012年3期
    關(guān)鍵詞:包被氯霉素化學(xué)發(fā)光

    何方洋,馮月君,吳 鵬,馮 靜,岳新榮,韓京朋

    (北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206)

    氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是20世紀(jì)中葉從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌中提取制得的一類廉價(jià)高效的廣譜抗生素[1-2],對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有很好的抑制作用,因此一度被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)中[3]。但是動物源性食品中的氯霉素藥物殘留隨著食物鏈被人體長期攝入,可引發(fā)各種危害和多種疾病。輕者破壞人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài),菌群失調(diào),使人體產(chǎn)生耐藥菌珠,給以后患病使用抗生素治療帶來不良影響;氯霉素過敏體質(zhì)的人會出現(xiàn)過敏反應(yīng),危及健康[4]。嚴(yán)重時(shí)可干擾骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,并抑制幼稚細(xì)胞DNA合成,導(dǎo)致粒細(xì)胞減少,引發(fā)再生障礙性貧血、溶血、紫癱等惡性疾病[5]。氯霉素殘留問題對人類健康構(gòu)成巨大的潛在威脅,已引起國際組織和世界上許多國家的高度重視[6],歐美等發(fā)達(dá)國家均在法規(guī)中對CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)作出了嚴(yán)格的規(guī)定[7]。我國農(nóng)業(yè)部2001年公告第24號文件規(guī)定,在馬肝、雞肉等中氯霉素的殘留限量為不得檢出,要求其檢測限量為1 ng/g;2002年公告第235號文件進(jìn)一步要求,氯霉素及其鹽、酯在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出[8]。

    為適應(yīng)更高的檢測標(biāo)準(zhǔn),檢測技術(shù)水平必須相應(yīng)的提高,因此氯霉素檢測技術(shù)一直是近十年來國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱門項(xiàng)目之一[9]。氯霉素的檢測方法分為物理化學(xué)法和免疫化學(xué)法,前者有液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法(MS)等,后者主要是酶免法(ELISA),檢測的靈敏度均達(dá)到ppb(μg/kg)級別[10-11]。當(dāng)前主流的檢測方法是液相色譜法——我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所使用的方法以及ELISA。近幾年,國內(nèi)外學(xué)者又研發(fā)出液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、液相色譜電噴霧電離質(zhì)譜法(LC-EITMS)、微生物分析等物理檢測新方法[12],同時(shí)對ELISA方法的應(yīng)用也有了進(jìn)一步研究。

    化學(xué)發(fā)光分析法是一種有效的微量和痕量分析法[13],與放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(ELA)相比,RIA和ELA檢測時(shí)間一般為75~120 min,化學(xué)發(fā)光方法檢測時(shí)間一般為18 min,靈敏度與RIA屬于同一檢測水平,檢測限可達(dá)10-12~10-20mol[14-15]。獸藥殘留中的化學(xué)發(fā)光免疫分析,不僅具有免疫反應(yīng)的特異性,而且具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏性,如果能將兩項(xiàng)技術(shù)有效的結(jié)合起來,那么將會開啟一項(xiàng)十分有發(fā)展前景的分析監(jiān)測技術(shù)。建立穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法,是進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制的基礎(chǔ),同時(shí)對于嚴(yán)把食品安全的檢驗(yàn)環(huán)節(jié)有重要的意義。

    1 材料

    1.1 儀器與設(shè)備 電子天平2000SBL(美國Setra);磁力攪拌器90-2(上海振榮科學(xué)儀器有限公司);微量移液器,單道 20~200 μL、100~1000 μL,多道50 ~300 μL(美國Thermo);氮吹儀DSY-Ⅲ(北京金科精華苑科技有限公司);QL-901漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);低速離心機(jī)Anke TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器有限公司 );CentroLB960微孔板式發(fā)光儀(德國Berthold);Opti-plateTM化學(xué)發(fā)光板(Perkin Elmer);生化培養(yǎng)箱DHP-600(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。

    1.2 試劑 氯霉素及其類似物標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfe公司);牛血清白蛋白 BSA、卵清蛋白OVA(Sigma公司);鹽酸、Pd/C催化劑、二甲基甲酰胺(DMF)、三丁胺、氯甲酸異丁酯、人糖化白蛋白(GA)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);辣根過氧化物酶 (美國Jackson公司);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(北京望爾生物技術(shù)有限公司);魯米諾發(fā)光底物液(Hyclone Pierce);其他有關(guān)化學(xué)試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1 抗原的合成

    2.1.1 免疫原的合成 將氯霉素溶于甲醇中,加入5%的Pd/C催化劑,通入氫氣,保持一定壓力,室溫反應(yīng)2 h,過濾除去Pd/C,蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體,即得氯霉素半抗原。將上述得到的目標(biāo)物在0~5℃下,用鹽酸調(diào)pH值為1~2,攪拌下滴加0.1~1 mol/L的NaNO2溶液,使淀粉碘化鉀試紙變藍(lán),再滴加0.1~1 mol/L尿素溶液,使淀粉碘化鉀試紙變淺藍(lán),再加0.1~1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為7~9,得到清液,作為溶液A備用。量取溶液A 21.8 mL加入DMF 3 mL中,4℃預(yù)冷10 min,加入三丁胺,混勻;并加入氯甲酸異丁酯,4℃攪拌20 min。稱取71.5 mg BSA溶于50%的DMF 10 mL中,4℃預(yù)冷。用1 mol/L NaOH調(diào)BSA的pH至8。將配制好的溶液A迅速加入BSA中,4℃攪拌反應(yīng)4 h。取氯霉素半抗原30 mg用1.5 mL水溶解;取50%的GA 10 μL加入前述半抗原溶解液中,室溫下攪拌反應(yīng)18 h;取BSA 100 mg用1.5 mL水稀釋后加入前述半抗原溶解液中;反應(yīng)過夜后加入24 mg NaBH4反應(yīng)3 h;用三蒸水透析48 h,即得免疫原[16]。

    2.1.2 包被原的合成 按2.1.1步驟反應(yīng),取氯霉素半抗原30 mg,OVA 100 mg,合成CAP-OVA,供包被用。

    2.2 單克隆抗體的制備 用上述制備出的免疫原(CAP-BSA)按150 μg/只,以生理鹽水溶解免疫復(fù)合物與弗氏完全佐劑等體積混勻,頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠,初次免疫后第7、14、28天以免疫復(fù)合物與弗氏不完全佐劑等體積混勻,各追加免疫1次,融合前3 d以免疫復(fù)合物100 μg/只,不加弗氏佐劑再追加免疫1次。按常規(guī)方法進(jìn)行,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合,然后在45 s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合,用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻,再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板,37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d后用HT培養(yǎng)基半換液,9 d時(shí)候進(jìn)行全換液,得到雜交瘤細(xì)胞,將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),收集上清液用間接ELISA測定效價(jià),凍存;并取8~10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只,7~10 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106~2×106/只,7~10 d后抽取小鼠腹水,離心取上清,測定效價(jià),并凍存?zhèn)溆肹17]。

    2.3 酶標(biāo)單克隆抗體制備 稱取5 mg辣根過氧化物酶溶于0.5 mL去離子水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL,混勻置冰箱30 min,取出加入0.16 mol/L乙二醇水溶液0.5 mL,于室溫放置30 min后加入含5 mg純化單克隆抗體的水溶液1 mL,混勻并裝透析袋對0.05 mol/L pH 9.5碳酸緩沖液緩慢攪拌透析6 h使之結(jié)合,吸出后加NaBH4溶液0.2 mL,置冰箱2 h。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨,冰箱放30 min后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02 mol/L pH 7.4 PBS中,并對之透析過夜,次日再離心除去不溶物,即得酶-抗體結(jié)合物,用0.02 mol/L pH 7.4 PBS加至5 mL進(jìn)行測定后冷凍干燥保存。

    2.4 氯霉素化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立[18]

    2.4.1 酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液將氯霉素包被原稀釋成10 μg/mL,每孔加入 100 μL,37 ℃溫育2 h,傾去包被液,然后在每孔中加入150 μL封閉液,37℃溫育2 h,傾去孔內(nèi)液體,用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌1次,拍干。

    2.4.2 確定抗原抗體最佳稀釋比例 采用方陣滴定法確定包被原與單克隆抗體的最佳工作濃度。將包被抗原按 160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列稀釋度包被酶標(biāo)板,將酶標(biāo)氯霉素單克隆抗體按 1 ∶1000、1 ∶2000、1 ∶4000、1 ∶8000、1 ∶16000、1 ∶32000、1 ∶64000、1 ∶128000、1∶512000的倍數(shù)進(jìn)行稀釋,用方陣法確定抗原抗體的最佳稀釋比例。

    2.4.3 氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的繪制 向用氯霉素偶聯(lián)包被原包被的酶標(biāo)板微孔中加入濃度分別為 0、20.0、60.0、180.0、540.0和1620.0 pg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL,再加入酶標(biāo)氯霉素單克隆抗體工作液50 μL,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜封板,25℃恒溫箱中反應(yīng)15 min,倒出孔中液體,重復(fù)洗板5次,拍干。每孔加入化學(xué)發(fā)光顯色液100 μL,輕輕振蕩混勻,3 min后用微孔板式發(fā)光儀測定每個(gè)孔的發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光強(qiáng)度平均值(RLU)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)品)的發(fā)光強(qiáng)度值(RLU0)再乘以100%,得到百分發(fā)光強(qiáng)度值,以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)的半對數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo),百分發(fā)光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

    2.4.4 檢測與其他藥物的交叉反應(yīng)率 用于抗體交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與氯霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似的藥物。按試劑盒程序操作,但加入的競爭物分別為不同的氯霉素類似物,制作抑制曲線,根據(jù)線性方程計(jì)算各競爭物50%抑制濃度(IC50)。交叉反應(yīng)率(CR%)即為抗體對氯霉素的IC50與抗體對競爭物的IC50之比的百分?jǐn)?shù),按下式進(jìn)行計(jì)算:

    2.4.5 豬肉中氯霉素殘留檢測 稱取(3.0±0.05)g去除脂肪的均質(zhì)樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中,加入6 mL乙酸乙酯,用振蕩器振蕩10 min,4000 r/min,室溫(20 ~25 ℃)離心 10 min;移取4 mL上層有機(jī)相(約相當(dāng)于2 g的樣本)至10 mL干凈玻璃試管中,于50~60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?加入1 mL正己烷,用渦旋儀渦動30 s,再加1 mL磷酸鹽緩沖液,用渦旋儀渦動1 min轉(zhuǎn)入2 mL離心管中,4000 r/min,室溫(20~25℃)離心15 min;除去上層有機(jī)相,取下層50 mL用于分析。

    2.4.6 最低檢測限、回收率及精密度 取20份空白樣品,按照2.4.5項(xiàng)步驟處理后所建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對應(yīng)的濃度。以20份空白樣品對應(yīng)的樣品濃度平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本檢測的最低檢測限。

    另取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別對豬肉樣品按照10、20 pg/g進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。分別抽取3個(gè)批次試劑盒進(jìn)行檢測,每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù),每個(gè)樣品2個(gè)平行,計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。

    3 結(jié)果

    3.1 包被抗原及HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數(shù)經(jīng)方陣滴定法確定包被抗原濃度為10 μg/mL,HRP-CAP單抗稀釋倍數(shù)為1∶16000時(shí),試驗(yàn)效果較理想(R2=0.9948、IC50=59.911 pg/mL),因此,確定抗原包被濃度為10 μg/mL,HRP-CAP單抗的稀釋倍數(shù)為1∶16000。

    3.2 競爭反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 按上述實(shí)驗(yàn)方法加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記抗體后測定室溫下反應(yīng)10、15、20以及25 min后加入發(fā)光溶液,測定0標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值,結(jié)果表明在反應(yīng)15 min時(shí)發(fā)光值最大(圖1),因此本試劑盒選取反應(yīng)時(shí)間為15 min。

    圖1 反應(yīng)時(shí)間與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系

    3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖2,IC50值為59.911 pg/mL,線性范圍為20~1620 pg/mL。

    圖2 氯霉素試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

    3.4 試劑盒特異性 氯霉素單克隆抗體對其類似物的交叉反應(yīng)率見表1??梢钥闯觯搯慰寺】贵w對其他幾種類似物的交叉反應(yīng)率均較低,其對氯霉素具有較好的特異性。

    表1 氯霉素試劑盒特異性試驗(yàn)

    3.5 最低檢測限 對20份空白豬肉樣本進(jìn)行檢測,測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為該方法對實(shí)際樣本的最低檢測限,結(jié)果見表2。由表得出空白豬肉樣品平均值為2.65 pg/g,標(biāo)準(zhǔn)差為2.20,最低檢測限為9.3 pg/g。

    表2 該方法對豬肉的最低檢測限 pg/g

    3.6 準(zhǔn)確度與精密度 ELISA法的準(zhǔn)確度以回收率表示,精密度以變異系數(shù)來表示。取豬肉樣本分別添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品至10、20 pg/g,對樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn),分別計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度,檢測結(jié)果見表3。

    表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果

    4 結(jié)論

    由于氯霉素是小分子物質(zhì),沒有免疫原性,所以必須連接到大分子載體上產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[19-20],本試驗(yàn)將氯霉素分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián),合成免疫原和包被原[21-24]。本研究根據(jù)間接競爭反應(yīng)原理建立快速檢測CAP的一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法,經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化,其最佳反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為10 μg/mL,包被溫度為37℃,反應(yīng)2 h,HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數(shù)為 1 ∶16000,競爭反應(yīng)15 min,洗滌液為 pH 7.4、含0.05%吐溫-20的PBST溶液。本研究所制備的單克隆抗體對氯霉素具有很高的特異性(IC50=59.911 pg/mL),并且對氯霉素抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,對其他氯霉素類似物的交叉反應(yīng)率較低,該試劑盒的線性范圍為20~1620 pg/mL,靈敏度為20 pg/mL,最低檢測限為10 pg/mL,樣本添加回收率在 76.3% ~94.7%之間,批內(nèi)變異系數(shù)在3.1% ~8.7%之間,批間變異系數(shù)在6.0% ~6.2%之間,完全能夠滿足對于氯霉素殘留檢測的要求。

    2002年1月,美國食品與藥品管理局(FDA)公布了禁止在進(jìn)口動物源性食品中使用氯霉素;歐盟的進(jìn)口食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“氯霉素含量標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出?!蔽覈r(nóng)業(yè)部也于2002年12月明文規(guī)定在所有動物的食品中不得檢出含有CAP及其鹽、酯等。其“不得檢出”的含義是氯霉素含量在1 ppb以下,即含量在十億分之一(ppb)級以下;德國部分州的特殊檢測標(biāo)準(zhǔn)為0.2 ppb。本試驗(yàn)方法的各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足檢測要求。經(jīng)檢驗(yàn),比常規(guī)ELISA的檢測效果更好,且可縮短反應(yīng)時(shí)間約60 min??梢姡砸徊绞交瘜W(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測動物組織中的CAP殘留更符合快速檢測的要求,實(shí)現(xiàn)了對CAP殘留的簡便、快速、精確檢測。

    [1]郝俊虎,王仙琴,閆永利,等.氯霉素殘留對出口畜產(chǎn)品的危害[J].飼料研究,2005,(5):3.

    [2]馬 玲,關(guān)忠誼,吳健敏,等.氯霉素殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫法的建立[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,42(2):205-208.

    [3]陳 鵬,羅曉琴.氯霉素殘留狀況及檢測方法[J].動物保健,2006,(10):41-42.

    [4]王自良,趙 坤,張改平.氯霉素的毒性及其在動物性食品中的殘留與檢測[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào),2005,33(2):101-105.

    [5]吳曉豐,楊鷺花.氯霉素殘留的危害及其檢測方法[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(3):41-43.

    [6]劉智宏.酶標(biāo)免疫測定法(EIA)在檢測動物性食品中氯霉素殘留的應(yīng)用[J].中國獸藥雜志,1995,29(2):47-48.

    [7]Shakila R Jeya,Saravanakumar R,Aunto Princy Vyla S,et al.An improved microbial assay for the detection of chloramphenicol residues in shrimp tissues[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies,2007,8(4):515-518.

    [8]農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號[S].

    [9]吳 皓,徐青軼.魚類氯霉素殘留檢測方法的研究進(jìn)展[J].水利漁業(yè),2005,25(3):4-5.

    [10]謝孟峽,劉 媛,邱月明,等.固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜測定動物組織中氯霉素的殘留量[J].分析化學(xué),2005,33(1):1-4.

    [11]蔣定國,文玉雪.高效液相色譜法測定牛奶中氯霉素殘留量的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2003,15(1):36-38.

    [12]宋 杰,宋燕青,王勇鑫,等.微生物法在檢測牛奶中氯霉素殘留的應(yīng)用[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,29(1):85-87.

    [13]高 巍.國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光法孕酮檢測試劑盒的評價(jià)[J].中國實(shí)用醫(yī)刊,2010,15:15.

    [14]胥傳來,彭池方,郝 凱,等.化學(xué)發(fā)光酶免疫方法檢測克侖特羅殘留[J].分析化學(xué),2005,33(5):699-702.

    [15]韓佩珍.化學(xué)發(fā)光免疫分析[J].國外醫(yī)學(xué):放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊,2000,24(5):196-201.

    [16]肖 智,李培武,張 奇,等.高特異性黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及特性研究[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2011,33(1):66-70.

    [17]王 謙.抗鏈霉素單克隆抗體制備與ELISA方法的建立[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

    [18]王壽利.鹽酸克侖特羅單克隆抗體的制備及其間接ELISA檢測方法的建立[D].江蘇:揚(yáng)州大學(xué),2009.

    [19]吳媛媛,包永明,王 龑,等.氯霉素全抗原的合成與鑒定[J].化學(xué)通報(bào)(印刷版),2005,68(6):6.

    [20]高彬文,張素霞,沈建忠,等.化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測魚蝦中氯霉素殘留[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43(5):68-69.

    [21]Xu Chuanlai,Peng Cifang,Hao Kai,et al.Chemiluminescence enzyme immunoassay(CLEIA)for the determination of chloramphenicol residues in aquatic tissues[J].Luminescence,2006,21(2):126-128.

    [22]Ke Li,Liqiang Liu,Chunlai Xu,et al.Rapid determination of chloramphenicol residues in aquaculture tissues by immunochromatographic assay[J].Analytical Sciences,2007,23(11):1281-1284.

    [23]石德時(shí),周 斌.氯霉素間接競爭ELISA(ciELISA)檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,22(1):77-79.

    [24]Cornelis van de Water,Nel Haagsma,Peter J S,et al.An enzymelinked immunosorbent assay for the determination of chloramphenicol using a monoclonal antibody application to residues in swine muscle tissue[J].European Food Research and Technology,1987,185(3):202-207.

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