雙菌種制曲改善黃酒麥曲品質(zhì)的研究*

余培斌，陳亮亮，張波，李國龍，謝廣發(fā)，蔡國林，陸健

1(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)2(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)4(中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興，312000)

黃酒是以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒［1］，“以麥制曲，用曲釀酒”是黃酒的特色［2］。麥曲作為黃酒生產(chǎn)的配料，其中含有多種微生物及其代謝產(chǎn)物，給黃酒釀造提供所需的酶，主要是淀粉酶和蛋白酶，淀粉酶把淀粉質(zhì)原料分解為低分子糖類，為酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶分解蛋白質(zhì)成肽和氨基酸等，為微生物的生長、繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也是黃酒中風(fēng)味物質(zhì)形成的前體。

麥曲分為生麥曲和熟麥曲，生麥曲采用傳統(tǒng)制曲工藝，利用生料，自然接種。麥曲中網(wǎng)羅了多種微生物，形成了特定的微生物群落，所釀的酒口味醇厚，香氣較濃，但由于生麥曲是自然培養(yǎng)，曲中主要酶類的活性都較低，在實(shí)際生產(chǎn)中用量較大，添加比例約為17%左右，釀造過程中發(fā)酵緩慢，殘?zhí)歉撸罄m(xù)處理時(shí)，壓榨困難［3］。熟麥曲是在傳統(tǒng)制曲的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，利用熟料，接種純種米曲霉蘇－16進(jìn)行培養(yǎng)。熟麥曲中淀粉酶活得到了顯著提高，但由于菌種單一，酶系簡單，所釀的黃酒口味寡淡，雜味較重。因此，改善黃酒麥曲品質(zhì)，可以考慮多菌種組合制曲。林祖申等采用米曲霉、黑曲霉混合制曲，明顯提高醬油質(zhì)量［4－5］，倪崢飛通過強(qiáng)化從醋醅中分離得到的多株功能微生物，縮短了鎮(zhèn)江香醋的發(fā)酵周期，同時(shí)也提高了香醋中的功能性物質(zhì)的含量［6］，在研究固態(tài)發(fā)酵飼料方面，也采用混菌發(fā)酵［7－8］。

在前期的研究中，本實(shí)驗(yàn)室從黃酒工廠的成品麥曲、原料、曲房、黃酒發(fā)酵液、周圍空氣等多種環(huán)境中分離到多株真菌，本文以這些真菌為出發(fā)菌株，篩選能夠影響麥曲質(zhì)量的功能微生物，通過生物強(qiáng)化技術(shù)，與傳統(tǒng)熟麥曲菌種混合發(fā)酵，以改善黃酒麥曲的品質(zhì)，并對(duì)制曲條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:取去皮馬鈴薯200 g，切塊，加1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min后紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.1.1.2 初篩培養(yǎng)基

產(chǎn)淀粉酶微生物初篩培養(yǎng)基:可溶性淀粉3 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3～5 g/L，NaCl 5 g/L瓊脂2% ，pH 7.2～7.4。

產(chǎn)蛋白酶微生物初篩培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，脫脂奶粉 3 g/L，瓊脂 2%，pH 7.0～7.2。

1.1.2 原料與試劑

粉碎小麥由紹興某黃酒廠制曲車間提供，麩皮購自無錫三里橋農(nóng)貿(mào)市場。菌株自紹興某黃酒廠環(huán)境中分離得到，由實(shí)驗(yàn)室保藏。

試劑:3，5-二硝基水楊酸、福林試劑、淀粉、三氯乙酸、酪素、碳酸鈉、瓊脂粉等，均為分析純，購自上海國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分生孢子懸液的制備

將活化后菌種的分生孢子用無菌水洗入三角瓶中，在超凈臺(tái)上用4層擦鏡紙過濾，旋渦振蕩均勻，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，孢子濃度調(diào)為107個(gè)/mL。

1.2.2 高產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶微生物的篩選

(1)初篩:取9 cm滅菌過的培養(yǎng)皿，每個(gè)加入初篩培養(yǎng)基20 mL，將原有保藏的菌種點(diǎn)植法接種到培養(yǎng)皿中，每皿點(diǎn)種3株霉菌，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈大小。

(2)復(fù)篩:根據(jù)初篩結(jié)果，從平板中挑選透明圈明顯的菌株，做孢子懸液，制作純種熟麥曲，以糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶酶活為篩選指標(biāo)，挑選酶活最高者作為目標(biāo)菌株。

1.2.3 菌種鑒定

(1)菌株形態(tài)鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)［9］介紹的方法和分類依據(jù)進(jìn)行初步的分類鑒定。

(2)菌株分子鑒定。染色體DNA的提取、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增和克隆測序:采用文獻(xiàn)［10］中的氯化芐法。采用真菌通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)［11］擴(kuò)增真菌 ITS區(qū)域。純菌株的PCR產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4 純種熟麥曲制曲工藝流程

純種熟麥曲的制做參考文獻(xiàn)［12］中相關(guān)章節(jié)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室做曲的特殊情況，將種曲接種改為孢子懸浮液接種。

1.2.5 粗酶液制備

(1)麥曲粗淀粉酶:稱麥曲10 g，加入1%NaCl溶液50 mL，30℃恒溫水浴1 h，每15 min搖晃1次，濾紙過濾，得粗酶液。

(2)麥曲粗蛋白酶:稱麥曲10 g，加入pH3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液50 mL，30℃恒溫水浴1 h，每15 min搖晃1次，濾紙過濾，得粗酶液。

1.2.6 酶活的測定及定義

(1)糖化酶酶活測定:參照方華［13］的測定方法。

酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在40℃，pH為4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活單位，以U/g表示。

(2)α-淀粉酶酶的測定:采用鈍化法測定［14］。

酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在60℃，pH 4.6的條件下，每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖為1個(gè)酶活單位，以U/g表示。

(3)蛋白酶酶活測定:采用福林酚法［15］。

參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活測定法(QB/T 1803－1993)。酸性蛋白酶測定pH為3.0。酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在40℃條件下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)蛋白酶活單位，以U/g表示。

1.3 麥曲培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情形，所以要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。結(jié)合工廠的實(shí)際，分別以培養(yǎng)時(shí)間、接種量、原料含水量為因素，以麥曲中蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶酶活為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Central Composite Design建立數(shù)學(xué)模型，選用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以培養(yǎng)時(shí)間、接種量、原料含水量為主要考察因素，合理選擇各因素水平，各因素水平及編碼如表1所示，利用Design Expert 7.0版本軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。該模型通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程可以表達(dá)為:Y

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)室保藏的從酒廠中分離得到的微生物(主要為真菌)共121株，經(jīng)平板初篩，得到能產(chǎn)淀粉酶的菌株為15株，能產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株13株，其中有8株菌既能產(chǎn)淀粉酶也能產(chǎn)酸性蛋白酶，將這20株菌做成純種熟麥曲，測定酶活，進(jìn)行復(fù)篩，得到產(chǎn)較高淀粉酶和酸性蛋白酶酶活的菌株2株，編號(hào)為ZW12和 GC3，2株菌與傳統(tǒng)熟麥曲所用菌株米曲霉蘇－16的酶活比較，見表2。

表2 不同菌株酶活比較

2.2 菌株GC3和ZW12的鑒定

2.2.1 菌株GC3和ZW12的培養(yǎng)形態(tài)特征

GC3菌株菌落生長快，在PDA平板上30℃培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)白色菌落，36 h后長滿整個(gè)平板，菌落蓬松成棉絮絲狀，白色菌絲中出現(xiàn)黑色孢子，背面無色。顯微觀察:菌絲匍匐爬行，假根發(fā)達(dá)，分枝呈指狀或根狀，孢囊梗直立，2～4株成束，與假根對(duì)生，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生孢囊孢子(見圖1)。ZW12菌株菌落生長較慢，在PDA平板上，30℃培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)一小團(tuán)白色菌落，菌落直徑約5 mm，36 h后，菌落變大且中間有白色棉絮突起，約40～60 mm，產(chǎn)生大量黃綠色孢子，背面出現(xiàn)淺淺的橘紅色。顯微觀察發(fā)現(xiàn):分生孢子頭放射狀，頂囊近球形，分生孢子幼時(shí)橢圓形，成熟后為球形或近球形(見圖2)。

2.2.2 菌株rDNA的ITS序列分析

對(duì)真菌GC3和ZW12的總DNA進(jìn)行提取，以總DNA為模板，利用真菌通用引物ITSl和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到ITSl—5.8S—ITS2序列，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，對(duì)回收純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序比對(duì)，結(jié)果表明，GC3的ITS序列同米根霉(Rhizopus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性為100%，真菌ZW12的序列同米曲霉(Aspergillus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性為99%，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，將GC3鑒定為米根霉，將ZW12鑒定為米曲霉。

圖2 菌株ZW12的宏觀及微觀形態(tài)特征

2.3 制曲菌株及混合比例的確定

將篩選出來的2株菌ZW12，GC3分別與米曲霉蘇－16混合制曲，混合時(shí)使用孢子懸浮液進(jìn)行，接種量為每50 g原料接種混合好的孢子懸浮液2 mL，在總接種量不變的情況下，改變混合比例，確定用于制曲的菌株及最優(yōu)的混合比例，結(jié)果見表3。由圖3可知在米曲霉蘇－16與ZW12混合接種時(shí)，隨著ZW12在菌種中比例的上升，α-淀粉酶和酸性蛋白酶的酶活呈顯著上升趨勢(shì)，表明菌株ZW12產(chǎn)α-淀粉酶和酸性蛋白酶能力較強(qiáng)，在米曲霉蘇－16與GC3混合接種時(shí)，隨著米曲霉蘇－16在菌種中比例的上升，糖化酶酶活呈顯著上升趨勢(shì)，表明米曲霉蘇－16產(chǎn)糖化酶較強(qiáng)，米曲霉蘇－16與GC3混合接種相對(duì)于與ZW12混合接種，糖化酶酶活整體偏高，酸性蛋白酶整體偏低，表明菌株GC3產(chǎn)酸性蛋白酶很弱，這與徐成勇等人的研究結(jié)果相一致［16］。綜合考慮，選定米曲霉蘇－16與ZW12混合為制曲菌種，混合比例為1∶2。

圖3 不同菌株不同比例混合接種酶活比較

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，接種量分別取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，培養(yǎng)時(shí)間取 24，28，32，36，42，48，52 h，原料含水量取 45%，50%，60%，70%，80%，90%，試驗(yàn)結(jié)果表明最佳培養(yǎng)條件分別為:接種量3.0 mL/50 g原料，培養(yǎng)時(shí)間48h，原料含水量80%。

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按中心組合設(shè)計(jì)確定的方案進(jìn)行制曲實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方案以及制曲中糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶活測定結(jié)果如表4所示。

表4 CCD設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 制曲各因素對(duì)響應(yīng)值糖化酶酶活的影響

對(duì)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以糖化酶為響應(yīng)值進(jìn)行方差分析和回歸分析，對(duì)各個(gè)變量的回歸系數(shù)和整個(gè)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，具體分析結(jié)果見表5。

表5 中心組合設(shè)計(jì)對(duì)糖化酶分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A(接種量)，B(培養(yǎng)時(shí)間)，C(原料含水量)對(duì)糖化酶活影響顯著?；貧w模型的P值＜0.000 1，表明模型極顯著，對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，模型變量 B，C，AB，AC，BC，C2高度顯著;A，B2也較顯著，一次項(xiàng)，二次項(xiàng)都有顯著性因素，因此各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值糖化酶的影響不是簡單的線性關(guān)系。

二次方程的擬合度可由決定系數(shù)R2、相關(guān)系數(shù)R、變異系數(shù)CV或者F值來反映。一個(gè)具有較好擬合度的二次方程模型，其R2至少為0.8［17］。通常CV值反映模型的置信度，即CV值越低模型的置信度越高。根據(jù)Jogleker的研究［18］，模型的 CV值在10以內(nèi)時(shí)，就意味著其置信度較高。僅考慮顯著項(xiàng)，制曲過程中各因素對(duì)糖化酶的影響可以通過以下多元回歸方程進(jìn)行描述:

糖化酶酶活=1067.18－29.74×A－50.76×B－111.75×C－138.30×AB+56.15×AC－55.78×BC－28.95×B2－58.93×C2

經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示模型方程高度顯著(P＜0.01)，模型的決定系數(shù)R2=96.30%，校正擬合度R2(Adj)=92.96%，變異系數(shù)CV值為4.27，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用響應(yīng)面分析法，找出了響應(yīng)變量(糖化酶活)的穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)不是最高值，只是一個(gè)鞍點(diǎn)。

2.5.2 制曲各因素對(duì)響應(yīng)值α-淀粉酶的影響

用同樣的方法對(duì)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以α-淀粉酶酶活為響應(yīng)值進(jìn)行方差分析和回歸分析，對(duì)各個(gè)變量的回歸系數(shù)和整個(gè)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，模型的P＜0.000 1，說明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型的模擬度極高。模型中參數(shù) A，C，AB，AC，B2顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.085 8，無顯著意義，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中無異常點(diǎn)，無需引入更高次項(xiàng)，模型可行。另外，模型的決定系數(shù) R2=94.48%，校正擬合度 R2(Adj)=89.52%，變異系數(shù)CV值2.14，表明該模型可以很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

僅考慮顯著項(xiàng)，制曲過程中各因素對(duì)α-淀粉酶的影響可以通過以下多元回歸方程進(jìn)行描述:

α-淀粉酶酶活 =13.05－0.21×A+0.35×C+0.79×AB－0.24×AC－0.58×B2

應(yīng)用響應(yīng)面分析法，找出了響應(yīng)變量(α-淀粉酶活)的穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)也是一個(gè)鞍點(diǎn)。

2.5.3 制曲各因素對(duì)響應(yīng)值酸性蛋白酶的影響

同樣對(duì)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以酸性蛋白酶酶活為響應(yīng)值進(jìn)行方差分析和回歸分析，對(duì)各個(gè)變量的回歸系數(shù)和整個(gè)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，模型的P＜0.000 1，說明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型高度顯著。模型中變量 C，AB，BC，A2，C2，B2顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中無異常點(diǎn)，無需引入更高次項(xiàng)，模型可行。模型的決定系數(shù)R2=99.20%，校正擬合度R2(Adj)=98.48%，變異系數(shù)CV值2.03，符合建立模型的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，所以該模型可以用于解釋實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

僅考慮顯著項(xiàng)，制曲過程中各因素對(duì)酸性蛋白酶的影響可以通過以下多元回歸方程進(jìn)行描述:

酸性蛋白酶酶活=344.51+21.81×C+13.86×AB－19.0×BC－27.39×A2－37.02×B2－20.51×C2

應(yīng)用響應(yīng)面分析法找出了響應(yīng)變量(酸性蛋白酶酶活)的穩(wěn)定點(diǎn)，此穩(wěn)定點(diǎn)為最大值。按照得到的數(shù)學(xué)模型繪制響應(yīng)曲面圖，見圖3～圖5。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間與接種量的交互作用

圖3～圖5直觀地給出了各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面和等值線分析圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出，在所選范圍類存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。從圖中可以直觀地看出，接種量、培養(yǎng)時(shí)間、原料含水量對(duì)酶活都有影響，特別是培養(yǎng)時(shí)間與接種量的交互作用影響較大，在響應(yīng)曲面圖中表現(xiàn)為曲面坡度大，變化明顯。

圖4 原料含水量與接種量的交互作用

圖5 培養(yǎng)時(shí)間與原料含水量的交互作用

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，制曲最優(yōu)工藝參數(shù)為，接種量2.75 mL/50 g原料，培養(yǎng)時(shí)間47.21 h，原料含水量81.01%，此工藝條件下3種酶活理論值分別為糖化酶1 063.1 U/g，α-淀粉酶13.3 U/g，酸性蛋白酶341.5 U/g。

2.5.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

在該模型的最優(yōu)點(diǎn)處做3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到3種主要酶活平均值分別為:糖化酶1 075.4 U/g，α-淀粉酶12.3 U/g，酸性蛋白酶346.7 U/g?？梢?，基于響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

(1)對(duì)從酒廠分離得到的真菌進(jìn)行篩選，得到產(chǎn)淀粉酶菌株15株，產(chǎn)蛋白酶菌株13株，其中部分菌株既能產(chǎn)淀粉酶也能產(chǎn)蛋白酶，此研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，黃酒麥曲的主要水解酶類來源于微生物。

(2)進(jìn)一步試驗(yàn)表明:米曲霉蘇－16與ZW12以1∶2的比例接種時(shí)，效果最好?；旌暇N最優(yōu)制曲條件為:培養(yǎng)時(shí)間47.21 h，原料含水量81.01%，接種量2.75 mL/50 g原料，培養(yǎng)溫度30℃。通過組合雙菌株制曲，較傳統(tǒng)的米曲霉蘇－16單菌種制曲，提高了主要水解酶類的酶活，改善了傳統(tǒng)熟麥曲酶系組成，混合菌種制得麥曲的糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶的酶活較傳統(tǒng)熟麥曲分別提高了3.5%、77.3%、59.7%。有關(guān)這一制曲條件下的成曲對(duì)黃酒釀造結(jié)果如淀粉及蛋白質(zhì)利用率、產(chǎn)品風(fēng)味、黃酒主要成分如總氮、總酸、糖分等的影響，將做進(jìn)一步的研究。

［1］黃酒，GB/T 13662－2000［S］.國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.

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