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    右歸膠囊改善糖尿病大鼠勃起功能障礙機制的實驗研究

    2012-11-21 12:29:22劉曉強郭宗華郭戰(zhàn)軍周曉亮
    世界中醫(yī)藥 2012年5期
    關(guān)鍵詞:海綿體陰莖功能障礙

    劉曉強 呂 崢 孫 光 郭宗華 郭戰(zhàn)軍 周曉亮

    (天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科A區(qū),天津市河西區(qū)平江道23號,300211)

    右歸丸是明代名醫(yī)張景岳所創(chuàng),功效溫補腎陽,填精止遺,中醫(yī)辨證屬腎陽虛精血虧虛者。用現(xiàn)代工藝將其制成膠囊,克服了原蜜丸的諸多缺點。右歸膠囊在治療糖尿病性勃起功能障礙中的作用機制尚不明確,本研究應(yīng)用糖尿病大鼠勃起功能障礙模型,觀察不同劑量右歸膠囊對DED大鼠勃起功能的影響及大鼠陰莖海綿體細胞凋亡及抗氧化指標變化,探討右歸膠囊在治療DED中的作用機制。

    1 材料

    試藥:右歸膠囊,由江西銀濤藥業(yè)有限公司提供,規(guī)格:0.45g/粒。動物:選用10周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只,體重(247±26)g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院放射醫(yī)學(xué)研究所提供(交配實驗證實勃起功能正常);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma);阿撲嗎啡(apomorphin,APO,Sigma);超氧化物歧化酶試劑盒、GSH試劑盒、GSH-Px試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;單克隆兔抗大鼠Bcl-2抗體、單克隆兔抗大鼠Bax抗體、山羊抗兔二抗顯色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;羅氏血糖儀及試紙等。STZ溶液配制:STZ溶解于0.1mmol/L檸檬酸 -檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5)中,濃度為20mg/mL,注意避光,現(xiàn)用現(xiàn)配。APO溶液:APO溶解于0.5mg/kg的維生素C與生理鹽水中,調(diào)整體積為5mL/kg。

    2 方法

    2.1 大鼠糖尿病模型的建立與阿樸嗎啡檢測勃起功能 70只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天,隨機選取60只為模型組,稱重后尾靜脈注射STZ溶液60mg/kg;余10只作為正常對照組,尾靜脈注射相應(yīng)劑量0.1mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模后96h斷尾采血測定隨機血糖,血糖>16.7mmol/L,出現(xiàn)多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀判定為造模成功。將造模成功的58只DM大鼠隨機分為4組,右歸膠囊高劑量組3.6g·kg-1(n=15)、中劑量組 2.4g·kg-1(n=14)、低劑量組 1.2g·kg-1(n=14)、生理鹽水對照組(n=15),以上各組均每日灌服給藥1次,持續(xù)10周。造模成功12周后,稱重后將大鼠置于透明觀察箱使大鼠適應(yīng)環(huán)境10min,保持室內(nèi)安靜、光線昏暗。大鼠頸項皮下注射阿撲嗎啡100μg/kg,觀察30min,記錄陰莖有無勃起、勃起次數(shù)及勃起潛伏期(從給藥到出現(xiàn)勃起的時間)。龜頭充血、末端陰莖體出現(xiàn)則認為勃起。未勃起的DM大鼠為糖尿病非ED,剔除出組。

    2.2 分光光度法檢測 處死動物,去除陰莖軟骨、皮膚、尿道海綿體等組織,取部分陰莖海綿體組織,用小剪刀剪碎組織后,置入勻漿管后在冰水中超聲勻漿后,應(yīng)用離心機3000r/min,離心10min。取上清進行相關(guān)指標測定。應(yīng)用比色法測定組織中抗氧化劑GSH、GSH-Px和SOD含量,衡量組織中抗氧化能力。

    2.3 免疫組化法檢測 將部分大鼠陰莖組織置入醋酸-乙醇-福爾馬林液中固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,石蠟切片,梯度下行脫蠟入水后用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,加入兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體,滴加生物素化二抗工作液,滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液,DAB顯色,梯度上行乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。400倍光鏡下觀察Bcl-2、Bax蛋白的表達及分布,每張切片至少觀察5個視野并進行細胞計數(shù),測定每個視野中表達Bcl-2、Bax蛋白的陽性細胞率(陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

    2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,結(jié)果用(±s)表示,組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

    3 結(jié)果

    3.1 DM模型建立及APO誘導(dǎo)實驗結(jié)果 60只注射STZ的大鼠中58只成模,成模率96.6%。飼養(yǎng)12周后各成模組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體重減輕等糖尿病癥狀。成模組大鼠因感染、酮癥酸中毒而死亡8只,病死率為13.7%。灌胃容積為1mL/100g,1日1次,連續(xù)12周,第12周后頸部皮下注射阿撲嗎啡100μg/kg,觀察30min內(nèi)各組大鼠勃起情況,并記錄勃起潛伏期,即從給藥開始到出現(xiàn)陰莖勃起的時間。陰莖勃起陽性率為每組中有陰莖勃起的大鼠的百分比。如表1,注射STZ 12周后,按APO誘導(dǎo)實驗未出現(xiàn)勃起者為ED的標準,高、中、低劑量組及DM組成DM性ED模型分別為10、12、12、10只,成糖尿病非勃起功能障礙模型剔除出組。正常對照組大鼠的陰莖勃起次數(shù)、勃起陽性率及勃起潛伏期與其余各組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。其余各劑量組之間陰莖勃起次數(shù)、勃起陽性率及勃起潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 對DM大鼠勃起功能的影響(±s)

    表1 對DM大鼠勃起功能的影響(±s)

    注:正常對照組勃起次數(shù)與其他各組組相比,**P<0.01。

    分組 例數(shù) 陰莖勃起陽性率(%)陰莖勃起次數(shù)勃起潛伏期(min)DM+高劑量組13 9.1 1 11 ±1 DM+中劑量組 13 8.1 1 13 DM+低劑量組 13 7.6 1 12 DM 組 11 9.1 1 15正常對照組 10 100 2.3 ±0.5**5±2

    3.2 各組大鼠陰莖海綿體組織 GSH含量及SOD、GSH-Px活性結(jié)果 表2表明,DM組大鼠與正常對照組相比,陰莖海綿體組織中GSH含量明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯降低;DM+右歸膠囊高劑量組與DM組相比,GSH含量增加,SOD、GSH-Px活性提高(P<0.05)。而右歸膠囊中、低劑量組與糖尿病組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    表2 大鼠陰莖海綿體組織中GSH含量及抗氧化物酶SOD、GSH-Px活性(±s)

    表2 大鼠陰莖海綿體組織中GSH含量及抗氧化物酶SOD、GSH-Px活性(±s)

    注:與正常對照組相比,**P<0.01;DM+高劑量組與DM組相比,*P<0.05。

    分組 數(shù)目 SOD(ng/mL)GSH(mgGSH/gprot)GSH-Px(U/mL)DM+高劑量組 10 282.12 ±18.24* 1.47 ±0.71* 172.34 ±12.48*10 332.71 ±29.23 2.13 ±0.35 198.21 ±9.23 DM+中劑量組 12 233.76 ±14.28 1.01 ±0.46 148.67 ±13.51 DM+低劑量組 12 245.69 ±14.12 1.11 ±0.23 133.95 ±14.73 DM 組 10 211.45 ±15.29** 0.81 ±0.21** 128.73 ±10.12**正常對照組

    表3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(±s,%)

    表3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(±s,%)

    注:DM組與正常對照組相比,**P<0.01;DM+高劑量組與DM組相比,*P <0.05。

    Bcl-2/Bax組別 數(shù)目 Bcl-2表達 Bax表達DM+高劑量組 10 16.78 ±4.23*10 24.56 ±2.34 12.11 ±1.34 2.01 16.62 ±2.34 1.01 DM+ 中劑量組 12 11.19 ±2.13 19.12 ±2.11 0.58 DM+ 低劑量組 12 12.06 ±2.61 18.45 ±3.81 0.65 DM 組 10 9.31 ±3.04** 20.23 ±2.11** 0.46正常對照組

    3.3 大鼠陰莖海綿體組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達 染色結(jié)果顯示,Bax、Bcl-2蛋白主要表達于陰莖海綿體血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的胞漿中,多以棕色、深棕色著色為主。正常對照組與其余各組相比,Bcl-2細胞陽性率高、Bax細胞陽性率低,Bcl-2/Bax比值較高;DM+右歸膠囊高劑量組與DM組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

    4 討論

    右歸膠囊是對原右歸丸在不改變其處方組成的基礎(chǔ)上,將蜜丸改為膠囊劑。附子、肉桂溫腎陽,暖下元;鹿角膠、杜仲、菟絲子補腎陽,益精血;熟地黃、山藥、山茱萸、當歸、枸杞子滋腎陰,養(yǎng)肝血。諸藥配伍,陽得陰助,體現(xiàn)“陰中求陽”法則。右歸膠囊中多種成分具有抗氧化應(yīng)激的作用,如熟地黃對慢性應(yīng)激性小鼠具有良好的抗氧化作用,并能有效的緩解慢性應(yīng)激引起的丙二醛含量升高、超氧化物歧化酶活性下降等[1]。臨床研究表明[2],右歸膠囊對于改善患者遺精、性功能減退有較好的改善臨床癥狀的作用。

    糖尿病是引起勃起功能障礙的常見原因,糖尿病患者ED患病率為25% ~75%,多在50%左右。雖然PDE5抑制劑等可有效改善部分患者的癥狀,但是仍有部分患者不能從中受益。因而對與糖尿病性ED的發(fā)病機制及有效治療有待于進一步的研究[2]。近年來研究表明,糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激有關(guān)。糖尿病時血液中高濃度的葡萄糖可通過活性氧引起氧化損傷破壞血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)進而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[3]。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)高活性分子如活性氧簇(ROS)產(chǎn)生過多或消除過少,引起組織損傷。生理情況下雖然有活性氧的產(chǎn)生,并不造成機體的氧化損傷,這主要是由于機體存在抗氧化防御系統(tǒng),包括抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等)和抗氧化劑(如谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素、輔酶Q及維生素C等)使機體處于氧化抗氧化的平衡狀態(tài)[4-5]。在病理狀態(tài)下活性氧產(chǎn)生增多、抗氧化酶和抗氧化劑合成減少活性降低,機體處于過氧化狀態(tài),即可造成機體的氧化損傷。糖尿病性ED大鼠海綿體組織中的抗氧化酶SOD、GSH-Px含量下降,GSH含量明顯減少,因此推斷右歸膠囊對DM性大鼠ED的保護,可能是通過增強SOD、GSH-Px的活性,增加GSH含量,增強抗氧化防御系統(tǒng)的能力,從而抑制機體內(nèi)活性氧對組織的損傷。右歸膠囊可以提高機體抗氧化能力,從而改善并延緩DM大鼠ED的氧化應(yīng)激損傷。

    糖尿病時由于產(chǎn)生較多活性氧與NO相互作用,形成促進細胞凋亡的因子,引起陰莖海綿體細胞凋亡[6]。機體處于過氧化狀態(tài)可能是誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵原因。陰莖細胞凋亡是引起勃起功能障礙的一個原因[7]。陰莖海綿體細胞凋亡是Bcl-2與Bax共同參與調(diào)節(jié)[8]。Bcl-2和Bax基因是與細胞凋亡關(guān)系最為密切的凋亡基因,Bcl-2是凋亡抑制基因,編碼產(chǎn)生Bcl-2蛋白,Bax是促調(diào)亡基因,編碼產(chǎn)生Bax蛋白。Bax可在細胞中自我形成同源二聚體或與Bcl-2形成異源二聚體。Bax-Bax促使細胞凋亡,而Bax-Bcl-2異源二聚體可以抑制細胞凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生[9],比例上調(diào)時,抑制細胞凋亡;比例下調(diào)時,促進細胞凋亡的發(fā)生。糖尿病大鼠勃起功能障礙的機制之一可能是陰莖海綿體細胞凋亡,平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡,平滑肌數(shù)目減少及結(jié)構(gòu)損害,直接影響平滑肌舒張功能,海綿竇舒張受限,動脈充盈受阻。其具體機制可能是糖尿病時,機體細胞內(nèi)鈣離子濃度增加,激活鈣離子依賴性激酶或磷酸酶,誘導(dǎo)凋亡基因的表達;亦可激活蛋白酶與核酸內(nèi)切酶,促進DNA的損傷;糖尿病時有多發(fā)神經(jīng)病變,推測海綿體神經(jīng)受損與細胞凋亡有關(guān)。右歸膠囊高劑量組糖尿病ED大鼠與糖尿病ED組大鼠相比,Bcl-2蛋白表達增多,Bax蛋白表達減少,Bcl-2/Bax比值較高,均提示右歸膠囊可以增加組織抗凋亡的能力,其抗凋亡能力是通過改善組織氧化應(yīng)激損傷實現(xiàn)的。但并未發(fā)現(xiàn)各組大鼠之間勃起陽性率之間的差異,推測可能的原因由于樣本量小、給藥時間較短造成,因此需要進一步深入研究。

    [1]張迪.熟地黃及其不同部位的抗氧化作用研究[D].山東大學(xué),2009.

    [2]薛維信.右歸膠囊治療遺精臨床療效觀察[J].江西中醫(yī)藥,2001,32(6):17.

    [3]饒可,劉繼紅.氧化應(yīng)激與男性勃起功能障礙[J].中國男科學(xué)雜志,2009,23(3):66-68.

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    [6]劉劍新,夏仁惠,傅梧,等.糖尿病大鼠陰莖細胞凋亡及血流動力學(xué)變化的研究[J].中華男科學(xué)雜志,2004,10(6):445-448.

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