20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹(shù)堿酯類(lèi)化合物的合成及其抗腫瘤活性

高 鵬， 朱 磊， 王佳樂(lè)， 王浦海， 孫 立， 袁勝濤

(1. 南京工業(yè)大學(xué) a. 藥學(xué)院； b. 江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 211816； 2. 中國(guó)藥科大學(xué) 國(guó)家南京新藥篩選中心，江蘇 南京 211009)

喜樹(shù)堿(1)是由Wall等[1]于1966年首次從珙桐科植物喜樹(shù)中分離得到的一種具有很強(qiáng)抗腫瘤活性的生物堿。構(gòu)效關(guān)系研究表明[2～4]，1分子中E環(huán)內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的完整性與其抗腫瘤活性密切相關(guān)，其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)是抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Topo Ⅰ)的重要基團(tuán)。1在體內(nèi)存在著閉環(huán)的內(nèi)酯形式和開(kāi)環(huán)的羧酸鹽形式之間的平衡，而在生理pH條件下，1極易由內(nèi)酯環(huán)形式開(kāi)環(huán)為羧酸鹽形式。人血漿白蛋白優(yōu)先與1的羧酸鹽形式結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使平衡向開(kāi)環(huán)的羧酸鹽形式移動(dòng)，導(dǎo)致體內(nèi)具有抗腫瘤活性的內(nèi)酯環(huán)含量很低，毒副作用增大。1分子中存在1個(gè)分子內(nèi)氫鍵，它不僅活化了內(nèi)酯環(huán)也削弱了羥基和酶的相互作用[5，6]。如果將1的20-位羥基酯化，勢(shì)必消除1分子內(nèi)氫鍵，增加鄰近羰基的位阻，降低羰基的活性，使親核試劑不易進(jìn)攻羰基，從而可減緩內(nèi)酯環(huán)在體內(nèi)的開(kāi)環(huán)，有利1發(fā)揮抗腫瘤作用。

研究發(fā)現(xiàn)[7，8]，在1的7-位引入親脂性基團(tuán)可以提高其脂溶性，增加穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)代謝時(shí)間，從而減少給藥量，降低藥物對(duì)人體的傷害，增加抗腫瘤活性。Tanizawa等[9]發(fā)現(xiàn)7-乙基在穩(wěn)定喜樹(shù)堿衍生物與DNA-TopoⅠ復(fù)合物的相互反應(yīng)中起著重要的作用。我們?cè)O(shè)想將1的20-位羥基酯化和7-位乙基化同時(shí)引入喜樹(shù)堿衍生物中，以期使兩者的協(xié)同作用來(lái)進(jìn)一步增加療效，降低毒副作用。

本文以1和正丙醛為原料，在冰醋酸-硫酸體系中以H2O2-FeSO4為自由基引發(fā)劑經(jīng)自由基烷基化反應(yīng)制得7-乙基喜樹(shù)堿(2)[10]；以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)為脫水劑，2在DMAP催化下與取代苯甲酸(3a～3k)直接酯化[11]，合成了11個(gè)新型的20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹(shù)堿酯類(lèi)化合物(4a～4k， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR和ESI-MS表征。初步測(cè)定了4a～4k對(duì)人肺癌細(xì)胞(LLC-E9FP)，人肺腺癌細(xì)胞(95D)，人胃癌細(xì)胞(BGC-803)，人胃癌細(xì)胞(HGC-27)和人肝癌細(xì)胞(7721)的增殖抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

X-4型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；AVANED AV-500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet IS 10型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters Q-TOF MicroTM型質(zhì)譜儀；EssentiaLC-15C型高效液相色譜儀[Luna十八烷基硅膠柱，流動(dòng)相：V(甲醇) ∶V(水)=80 ∶20， 267 nm)。

CompabcdefghijkR1HHHHHHNO2NO2HHCF3R2HFClBrINO2HHCNCF3HR3HHHHHHHNO2HHH

Scheme1

1，成都瀾綺制藥有限公司；EDCI和DMAP，蘇州昊帆生物科技有限公司；其余所用試劑均為分析純，其中CH2Cl2經(jīng)CaH2回流干燥處理，丙醛用前重蒸。

1.2 合成

(1)2的合成

將13.00 g(8.6 mmol)溶于冰醋酸(80 mL)中，于5 ℃～10 ℃緩慢滴加98%硫酸20 mL，滴畢，攪拌至亮黃色得溶液A。

在三口燒瓶中加入FeSO4·7H2O 2.50 g(9 mmol)和去離子100 mL，攪拌使其溶解；于2 ℃左右加入溶液A，攪拌均勻后滴加正丙醛3.00 mL(40 mmol)，滴畢，待體系溫度降至2 ℃左右時(shí)緩慢滴加30%H2O22.40 mL(15 min);反應(yīng)45 min。傾入250 mL冰水中，靜置1.0 h，過(guò)濾，濾液用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，減壓濃縮至干得黃色固體。經(jīng)硅膠(100目～200目)柱層析(洗脫劑:氯仿)純化得淡黃色粉末22.40 g，純度99.0%(HPLC，下同)，收率74.0%， m.p.259 ℃～260 ℃(259 ℃～261 ℃[12])；1H NMRδ: 1.04(t,J=7.3 Hz, 3H, 19-CH3), 1.42(t,J=7.5 Hz, 3H, 30-CH3), 1.88(m, 2H, 18-CH2), 3.22(q, 2H, 29-CH2), 3.80(s, 1H, 20-OH), 5.29(s, 2H, 5-CH2), 5.30(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 5.75(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 7.68(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-CH), 7.71(s, 1H, 14-CH), 7.81(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-CH), 8.13(d,J=8.5 Hz, 1H, 9-CH), 8.26(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-CH)； IRν： 3 373, 1 757, 1 658, 1 607, 1 155 cm-1。

(2) 4的合成(以4a為例)

在三口燒瓶中加入苯甲酸(3a)0.73 g(6 mmol)的CH2Cl2(100 mL)溶液，冰浴(2 ℃)冷卻下攪拌均勻；依次加入20.75 g(2 mmol)， EDCI 1.53 g(8 mmol)及DMAP 1.47 g(12 mmol)，避光攪拌15 min。拆去冰浴，升至室溫，避光反應(yīng)2.0 h(淡黃色澄清溶液)。傾入100 mL冰水中洗滌，分液，有機(jī)層依次用稀酸(pH=3.3)，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓濃縮至1/10體積后經(jīng)硅膠柱層析[梯度洗脫劑：V(CH2Cl2) ∶V(THF)=100 ∶0～95 ∶5]純化得類(lèi)白色粉末，用CH2Cl2/MeOH重結(jié)晶得4a0.62 g，純度99.0%，收率64.4%。

用類(lèi)似的方法合成4b～4k。

1.3 抗腫瘤活性測(cè)試[13，14]

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)(2～4)×104個(gè)·mL-1，制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180 μL/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換液，加入受試藥物，20 μL/孔，培養(yǎng)72 h。將MTT試劑加入96孔板中，20 μL/孔，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。吸去上清液，加入DMSO， 150 μL/孔，平板搖床上振搖5 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定每孔的吸光值(OD)，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率{抑制率=[(OD對(duì)照-OD藥敏)/OD對(duì)照]×100%}。

2 結(jié)果與討論

2．1 合成

在2的合成中，1溶解性差，需在冰醋酸中加入98%硫酸助溶，提供H+與喹啉環(huán)上的氮原子結(jié)合形成銨鹽，增強(qiáng)1的溶解性，最佳的比例為V(冰醋酸) ∶V(濃硫酸)=4 ∶1，即能形成均相溶液又不至于酸過(guò)量引發(fā)大量副反應(yīng)。H2O2作為親核試劑進(jìn)攻醛基，在FeSO4·7H2O的引發(fā)和H2O2存在下生成?；杂苫琀2O2過(guò)量易引發(fā)副反應(yīng)，F(xiàn)eSO4·7H2O過(guò)量則使最終產(chǎn)物顏色加深，最佳的n(FeSO4·7H2O) ∶n(H2O2)=3 ∶1。

在4的合成中，考慮到該反應(yīng)的空間位阻，采取了亞胺催化進(jìn)行縮合。先采用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/DMAP體系，發(fā)現(xiàn)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程很緩慢，平均反應(yīng)時(shí)間在12 h以上，推測(cè)可能是DCC的亞胺兩端所連基團(tuán)位阻較大不易與苯甲酸的羥基結(jié)合所致。改用位阻較小的EDCI后，反應(yīng)速率明顯提高。使用催化量的DMAP時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率不高(25%)且時(shí)間長(zhǎng)(6 h左右)，當(dāng)增加DMAP用量時(shí)反應(yīng)明顯加快且收率提高，當(dāng)n(2) ∶n(3) ∶n(EDCI) ∶n(DMAP) =1 ∶3 ∶4 ∶6時(shí)，反應(yīng)基本在2 h左右完成且收率穩(wěn)定(>65%)；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)3上的基團(tuán)對(duì)反應(yīng)收率亦有影響，當(dāng)苯甲酸上的取代基為強(qiáng)吸電子基團(tuán)時(shí)，苯甲酸與EDCI形成中間態(tài)的羰基正電性增強(qiáng)有利于2的20-位羥基的親核取代的發(fā)生，如-NO2， -CF3存在時(shí)總收率能達(dá)到80%以上。

合成4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，表征數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表1 合成4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Experimental results of synthesizing 4

表2 4的1H NMR和IR數(shù)據(jù)Table 2 1H NMR and IR data of 4

續(xù)表2

Comp.1H NMR δ(J/Hz)IR ν/cm-14h1.13(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.39～2.53(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.29(s, 2H, 5-H), 5.49(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.79(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.65(t, J=9.8, 1H, 10-H), 7.75(q, 1H, 11-H), 8.10(t, J=9.8, 2H, 9,12-H), 8.40(d, J=7.5, 1H, 24-H), 8.46(m, 1H, 26-H), 8.93(s, 1H, 28-H)3 166, 2 972, 2 942, 2 881, 1 772, 1 742, 1 661, 1 605, 1 544, 1 345, 1 277, 1 165, 1 077, 762, 7204i1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.33～2.45(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.28(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.67(t, J=7.8, 1H, 10-H), 7.78(t, J=8.0, 3H, 11,25,27-H), 8.11～8.20(m, 4H, 9,12,24,28-H)3 604, 2 978, 2 940, 2 880, 2 231, 1 757, 1 734, 1 667, 1 618, 1 453, 1 277, 1 155, 1 102, 858, 765, 7084j1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.34～2.47(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.64(t, J=7.5, 1H, 10-H), 7.78(q, 3H, 11,25,27-H), 8.14(q, 2H, 9,12-H), 8.22(d, J=8.0, 2H, 24,28-H)2 975, 2 938, 2 882, 1 760, 1 732, 1 665, 1 613, 1 326, 1 276, 1 160, 1 130, 1 100, 1 065, 860, 766, 7034k1.09(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.35～2.49(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.62～7.79(m, 2H,10,25-H), 7.77(t, J=8.0, 1H, 11-H), 7.88(d, J=7.5, 1H, 26-H), 8.12(d, J=8.0, 1H,9-H), 8.16(d, J=8.5, 1H, 24-H), 8.29(d, J=8.0, 1H, 12-H), 8.36(s, 1H, 28-H)3 499, 2 980, 2 941, 2 882, 1 763, 1 729, 1 664, 1 613, 1 454, 1 337, 1 254, 1 122, 1 070, 975, 825, 759, 696

2.2 抗腫瘤活性

4的抗腫瘤活性結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，4b和4e對(duì)LLC-E9EP的抑制率都超過(guò)了喜樹(shù)堿母核；4h， 4j和4k對(duì)95D也有明顯的抑制作用(抑制率分別為55.03%， 49.09%和48.51%)；但4a～4k對(duì)BGC-803的抑制作用較弱；對(duì)HGC-27， 4j有比較明顯的抑制作用(抑制率48.12%)；4d,4h和4k對(duì)7721有較為明顯的抑制活性(抑制率分別為45.98%, 44.99%和49.13%)。

由體外活性篩選的初步結(jié)果可以看出：喜樹(shù)堿的7-位乙基化和20-位取代苯甲酸酯化對(duì)喜樹(shù)堿抗腫瘤活性的提升起了積極作用；同時(shí)可以推測(cè)此類(lèi)化合物的活性差異可能是由取代苯甲酸的取代基決定：當(dāng)取代基為強(qiáng)吸電子基團(tuán)時(shí)表現(xiàn)為較好的抗腫瘤活性；當(dāng)取代基為鹵素時(shí)對(duì)LLC-E9FP抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)；沒(méi)有取代基時(shí)大多無(wú)活性。由于此類(lèi)化合物具有較好的體外抗腫瘤活性，其體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。

表3 4對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率*Table 3 Inhibition rates of 4to cancer cells

*c=1．0×10-6mol·L-1； LLC-E9FP：人肺癌細(xì)胞； 95D：人肺腺癌細(xì)胞； BGC-803：人胃癌細(xì)胞； HGC-27：人胃癌細(xì)胞； 7721：人肝癌細(xì)胞

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