進(jìn)展期胃癌組織中EGFR和PI3K的表達(dá)及相關(guān)性

宮海濤 程永遠(yuǎn) 程鴿 辛玲 王雪梅 姜慧峰

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在世界范圍居第二位［1］，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。胃癌也是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，居我國(guó)惡性腫瘤病死率第一位。由于大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬進(jìn)展期，傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療整體療效不佳。靶向治療是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，已在腫瘤治療中顯示出高效、低毒等特點(diǎn)。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)EGFR和PI3K在進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)情況，探討二者表達(dá)的特點(diǎn)及其相關(guān)性，為以EGFR和PI3K為靶點(diǎn)的生物制劑在進(jìn)展期胃癌中的應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬萊陽(yáng)中心醫(yī)院2004年1月到2005年10月間手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的進(jìn)展期胃癌石蠟包埋組織標(biāo)本68例。所有患者術(shù)前均未接受放化療。術(shù)后病理診斷為胃腺癌。68例患者中位年齡49歲(36～69歲)，≤60歲47例，＞60歲21例。男45例，女23例，男女比例1.96∶1。按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)高分化腺癌19例，中低分化腺癌49例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。按照AJCC(第7版)胃癌分期系統(tǒng)，Ⅱ期22例，Ⅲ期30例，Ⅳ期16例。并選擇同期胃潰瘍病例正常胃切除標(biāo)本15例作為對(duì)照組。標(biāo)本取材大小0.5 cm×1.0 cm×0.5 cm，組織標(biāo)本用10%甲醛固定。所有患者術(shù)前均未接受放化療。

1.2 試劑與方法 EGFR鼠源性人單克隆抗體和PI3K鼠源性人單克隆抗體由福州邁新生物技術(shù)公司提供。采用免疫組織化學(xué)SABC法，具體操作步驟如下:石蠟切片逐級(jí)脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，高溫高壓熱修復(fù)，2%牛血清封閉20 min，滴加一抗(EGFR稀釋濃度為1∶100;PI3K稀釋濃度為1∶50)，濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過(guò)夜后滴加二抗，室溫20 min，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素，DAB顯色，脫水，透明，封片。結(jié)果判定后再進(jìn)行蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 由兩位有臨床經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀。EGFR和PI3K陽(yáng)性染色均為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。采用二級(jí)計(jì)分法，根據(jù)細(xì)胞染色程度分類:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕褐色為3分;根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占5個(gè)以上高倍視野比例計(jì)數(shù)分為5類:5%以下為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76%以上為4分。根據(jù)二者乘積判斷陽(yáng)性等級(jí):0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，樣本率的比較使用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR和PI3K的表達(dá) 本研究表明，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，主要定位于細(xì)胞膜上，PI3K的陽(yáng)性表達(dá)呈明顯棕黃色，主要定位于定位于細(xì)胞核和部分細(xì)胞質(zhì)上。EGFR和PI3K的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.82%(40/68)和76.47%(52/68)。在正常胃組織中無(wú)表達(dá)。胃癌組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)率:在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中為73.91%較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27.27%明顯高(P＜0.05);TNM分期Ⅲ期、Ⅳ期的胃癌為67.39%較Ⅱ期36.36%高(P＜0.05);在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌組織中為81.25%較無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移51.92%高(P＜0.05)。由此可見(jiàn)，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而在浸潤(rùn)深度和分化程度等方面無(wú)差異。PI3K在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.64%(14/22)、80.00%(24/30)、87.50%(14/16)，臨床分期越晚，PI3K陽(yáng)性表達(dá)率也越高(P＜0.05)，PI3K在高分化、中分化和低分化胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.16%(12/19)、76.92%(20/26)、86.96%(20/23)，分化越差PI3K表達(dá)越強(qiáng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 進(jìn)展期胃癌中EGFR和PI3K的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系(例，%)

2.2 EGFR和PI3K表達(dá)的相關(guān)性分析 52例PI3K表達(dá)陽(yáng)性胃癌組織中有25例EGFR表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為48.08%，16例PI3K表達(dá)陰性病例中有3例EGFR表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率僅為18.75%，PI3K表達(dá)陽(yáng)性胃癌組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)明顯高于PI3K陰性者(P＜0.05)，即二者在進(jìn)展期胃癌組織中表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性的百分率較高，表明二者在進(jìn)展期胃癌中有共同表達(dá)現(xiàn)象。Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，進(jìn)展期胃癌組織中EGFR表達(dá)和PI3K之間具有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)廣泛表達(dá)于表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞、部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)中起十分重要的作用。EGFR是受體型酪氨酸蛋白激酶，它與相應(yīng)配體結(jié)合以后，主要通過(guò)PI3K通路將信號(hào)傳入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞增殖、增加新生血管生成、促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，高水平EGFR反映了腫瘤的高增殖、高惡性度、高術(shù)后復(fù)發(fā)率及預(yù)后不良。近年來(lái)，多篇文獻(xiàn)［2-8］報(bào)道EGFR在胃癌組織中存在過(guò)度表達(dá)，過(guò)度表達(dá)率基本在40% ～65%之間，而對(duì)照組［3，4］正常胃黏膜組織中EGFR無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為零。據(jù)此可以確定在正常胃組織中EGFR的表達(dá)很低，而在胃癌組織中存在著過(guò)度表達(dá)。本研究EGFR在胃癌組織中的表達(dá)率為58.82%(40/68)，其過(guò)度表達(dá)率明顯高于正常胃組織，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期有關(guān)。因此，EGFR過(guò)度表達(dá)可作為判斷胃癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)。

磷脂酸肌醇-3激酶(PI3K)是由Sugimoto等于1984年發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是磷脂激酶家族中的一個(gè)重要成員，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，通過(guò)多種途徑進(jìn)行與細(xì)胞生長(zhǎng)及存活有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PI3K在卵巢癌［9，10］發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。PI3K是T淋巴細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，通過(guò)激活下游底物蛋白激酶B(Akt)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)骨架蛋白重排、促進(jìn)細(xì)胞間粘附等功能。本研究PI3K在進(jìn)展期胃癌組織中表達(dá)率為76.47%(52/68)，呈過(guò)度表達(dá)特征，明顯高于正常胃組織，差異有顯著性，提示PI3K的高表達(dá)與胃癌的形成及進(jìn)展有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究了進(jìn)展期胃癌組織中EGFR和PI3K表達(dá)的相關(guān)性，在進(jìn)展期胃癌組織中EGFR和PI3K二者存在著共同高表達(dá)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，進(jìn)展期胃癌組織中EGFR和PI3K具有顯著正相關(guān)。對(duì)二者病理特點(diǎn)及其相關(guān)性的研究為靶向EGFR抑制劑和靶向PI3K抑制劑在進(jìn)展期胃癌綜合治療中的應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用提供了一定的分子學(xué)依據(jù)。

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