正交法優(yōu)選夜寧膠囊中靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝的研究

周曉東 李瑩 丁青龍

正交法優(yōu)選夜寧膠囊中靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝的研究

周曉東 李瑩 丁青龍

目的 用正交試驗(yàn)研究中藥?kù)`芝中鎮(zhèn)靜成分的提取工藝。方法 采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以出膏率和靈芝多糖及總糖含量為指標(biāo)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定浸膏中靈芝多糖及總糖含量，篩選最佳工藝條件。結(jié)果 40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h為最佳工藝。結(jié)論 以正交試驗(yàn)法優(yōu)選的靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝方法簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，效果滿(mǎn)意，從而確保質(zhì)量。

靈芝;靈芝多糖;總糖;提取工藝;正交試驗(yàn)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥實(shí)體。在中醫(yī)臨床應(yīng)用已有悠久的歷史，自古認(rèn)為有益氣血，安心神，健脾胃之功效。主治虛勞，心悸，失眠，頭暈，神疲乏力，久咳氣喘等。古代很多文獻(xiàn)對(duì)其都有記載：《新修本草》：“芝安心神”，《本草綱目》：“紫芝療虛癆”;《中國(guó)藥用植物圖鑒》：“治神經(jīng)衰弱、失眠、消化不良等慢性疾病?！?《中國(guó)中草藥匯編》：“滋養(yǎng)強(qiáng)壯。主治頭暈，失眠，神經(jīng)衰弱，高血壓病，血膽固醇過(guò)高癥，肝炎，慢性支氣管炎，哮喘等病。”;《中國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)品補(bǔ)藥》：“養(yǎng)心安神，補(bǔ)肺益肝。適用于血不養(yǎng)心，心悸失眠健忘，肺虛咳喘，久咳不好，以及肝炎恢復(fù)期，神疲納呆等癥?！?。

現(xiàn)代藥理研究證明其醇水提取液可明顯增強(qiáng)戊巴比妥鈉的中抑制作用(翻正反射消失)，并有抗電驚厥作用［1］。本文采用分光光度法測(cè)定了靈芝醇水提取物中總糖及靈芝多糖的含量，方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可作為靈芝提取物的質(zhì)量及工藝的控制方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

原料：干燥實(shí)體多孔菌科真菌赤芝。試劑：乙醇，苯酚，硫酸等試劑均為分析醇，水為重蒸餾水，堿性酒石碳酸銅溶液試藥：99.99%葡萄糖。

1.2 儀器

752型紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器廠(chǎng));FQC-100超聲波清洗機(jī)(無(wú)錫福尼達(dá)電子公司，40KHz)80-2型臺(tái)式離心機(jī)(上海分析器械廠(chǎng));電子分析天平，RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青鋪滬西儀器廠(chǎng))，SC202-1型電熱恒溫干燥箱(通州市滬通制藥機(jī)械設(shè)備廠(chǎng))，F(xiàn)A1004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠(chǎng))，植物粉碎機(jī)(中國(guó)天津泰新特儀器有限責(zé)任公司)

1.3 方法

1.3.1 提取方法 分別采用回流提取法、超聲提取法、浸漬提取法，應(yīng)用L9(34)正交表實(shí)施實(shí)驗(yàn)

1.4 靈芝在不同提取工藝和不同濃度的乙醇溶液中的總糖和靈芝醇溶性多糖的含量測(cè)定。

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取在105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖9.8 mg置100 ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.2 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取各組正交試驗(yàn)105℃干燥至恒重的靈芝浸膏等量于離心管中中加水至10 ml，超聲30 min溶解，定容至10 ml，得總糖供試液(1)。將總糖供試液用85%乙醇處理至無(wú)單糖存在(用堿性酒石酸銅檢查)得多糖供試液(2)［2］。

1.4.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0 ml，樣品液0.2 ml，陰性對(duì)照液0.2 ml，以同量蒸餾水為空白，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下操作后，在UD光度計(jì)上對(duì)400～600 nm波長(zhǎng)區(qū)間進(jìn)行掃描，得最大吸收波長(zhǎng)λmax為490 nm，并且在此波長(zhǎng)處陰性對(duì)照液的吸光度值在0.005以下，不影響測(cè)定，故選用490 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)［3］。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別精密吸收0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml標(biāo)準(zhǔn)液于10 ml容量瓶中加蒸餾水至1.0 ml分別加新配制的5%苯酚1.5 ml再加98%H2SO47.5 ml，充分搖勻置室溫下反應(yīng)20 min至恒溫后在490 nm處測(cè)吸收度［4］，并進(jìn)行回歸處理：A=665.8163C-0.0357，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

1.4.5 供試品溶液的測(cè)定 分別精密量取樣品溶液(1)、(2)0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下操作，測(cè)得吸收度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。

1.5 提取工藝

1.5.1 原藥材的處理 取靈芝原藥材，粉碎，過(guò)目篩分樣，置65℃烘箱中烘2 h，置干燥器中冷卻至室溫，備用。

1.5.2 回流提取法

1.5.2.1 工藝流程 稱(chēng)取不同目數(shù)藥材5 g→回流提取→抽濾→回收乙醇→測(cè)定浸膏量、靈芝多糖和總糖含量。

1.5.2.2 因素-水平表

3.2.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評(píng)分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.2198

表1

表2

加權(quán)評(píng)分結(jié)果確定：A1B3C2D3其中RA＞RB＞RC＞RD

即回流最佳提取工藝為：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h。

3.3 超聲提取法

3.3.1 工藝流程 稱(chēng)取藥材粉末→超聲提取→抽濾→回收溶劑→測(cè)定總糖、多糖含量、測(cè)定浸膏量。

3.3.2 因素-水平表

表3

3.3.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評(píng)分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.8037

表4

加權(quán)評(píng)分結(jié)果確定：A1B3C1D3其中RD＞RA＞RB＞RC

即超聲最佳工藝為：＞40目藥材粉末加相當(dāng)于藥材30倍量的70%乙醇超聲20 min。

3.4 浸漬提取法

3.4.1 工藝流程 稱(chēng)取不同目數(shù)藥材粉末1 g→浸漬不同天數(shù)→回收溶劑→測(cè)定總糖、多糖含量、測(cè)定浸膏量

3.4.2 因素-水平表

表4

3.4.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評(píng)分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.4647

表5

加權(quán)評(píng)分結(jié)果確定：A1B3C2D3其中RA＞RD＞RC＞RB

確定最佳工藝為：40倍量的70%乙醇，大于40目的靈芝粉浸漬8 d。

3.5 最佳工藝的確定

選擇回流提取法、浸漬提取法和超聲提取法中的最佳工藝條件，每組重復(fù)五次，結(jié)果如表所示。其中加權(quán)評(píng)分公式為：

表6

兩兩比較三個(gè)總體均數(shù)的差異

表7

4 結(jié)果處理

先將回流組和超聲組作比較：ta=(X1－X2)/(Sw√n1-1+n2-1)=23.9788對(duì) α =0.05，f=5+5-2=8，查表得 t0.05/2(8)=2.306故|t|＞tα/2即P＜0.05，故回流組和超聲組其差異有顯著性意義，且回流組高于超聲組。

再將含量較高的回流組和浸漬組作比較：ta=6.2820，即|t|＞tα/2，P＜0.05，故回流組和浸漬組的差異也有顯著性意義，且回流組高于浸漬組。經(jīng)過(guò)兩兩正態(tài)總體均數(shù)的差異的比較可知：回流組評(píng)分分別高于另外超聲，浸漬兩組。因此得出：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h為最佳工藝。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)利用正交表，對(duì)多因素、多水平且各因素間存在相互作用而具有隨機(jī)誤差的試驗(yàn)，通過(guò)少數(shù)代表性強(qiáng)的試驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)分析方法，較快地找出合理的試驗(yàn)方案，省時(shí)省力，方法可取。

由于正交試驗(yàn)時(shí)無(wú)空白對(duì)照組且無(wú)重復(fù)試驗(yàn)，故只采用了直觀方差分析法。在三種方法的最佳工藝確定時(shí)，采用了以少量樣本比較正態(tài)總體均數(shù)差異的方法，可信度較高。

現(xiàn)代藥理研究表明靈芝的醇提液對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中樞神經(jīng)有明顯的抑制作用，有協(xié)同本巴比妥的對(duì)中樞神經(jīng)的以致作用，因目前對(duì)靈芝的質(zhì)量還沒(méi)有可靠的標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到靈芝中有部分醇溶性的糖，而目前對(duì)靈芝研究較多的也就是其中的糖類(lèi)物質(zhì)，故以其中的醇溶性的糖作在提取過(guò)程中的一個(gè)考察指標(biāo)。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草·上冊(cè)(精選本).上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996，172.

［2］仇萍，袁濤，王美麗.靈芝口服液中靈芝多糖含量測(cè)定方法研究.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2000，6(3)：37.

［3］單衛(wèi)華，張玲，時(shí)延增，梁瑞雪，尚立霞，胡慶文.靈芝菌酵液制劑中靈芝多糖及總糖含量測(cè)定.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(9)：797.

［4］張春華，周永治，劉延福，等.數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法.山東大學(xué)出版社，1994：151-181，250.

211131 南京軍區(qū)總醫(yī)院湯山分院藥械科(周曉東);南京中醫(yī)藥大學(xué)(李瑩 丁青龍)

1.3.2 浸膏得率的測(cè)定

1.3.2.1 蒸發(fā)皿的預(yù)處理 蒸發(fā)皿置烘箱中105℃烘1 h，置干燥器中冷卻至室溫，稱(chēng)重W1，繼續(xù)烘30 min，置干燥器中冷卻至室溫，稱(chēng)重W2，當(dāng)W1與W2差之絕對(duì)值≤0.3 mg時(shí)，置干燥器中備用。

1.3.2.2 浸膏量的測(cè)定 剩余提取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓回收溶劑至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置烘箱中105℃干燥2 h得干浸膏，稱(chēng)重W，計(jì)算W-(W1+W2)/2值。