水辣蓼中2種黃酮類成分含量測定

張宏武，任恒春，丁 剛，李榕濤，魏建和，鄒忠梅(.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所，北京0093;.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧57533)

水辣蓼為蓼科植物水辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.)的全草，別名柳草、蓼子草、斑蕉草、蝙蝠草等。全草均可入藥，水辣蓼味辛，溫;具有祛風(fēng)利濕，散瘀止痛，解毒消腫等功效;主要用于痢疾、腸胃炎、腹瀉、腳氣、疥癬、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打腫痛、功能性子宮出血;外用治毒蛇咬傷、皮膚濕疹等癥狀［1］。近年研究表明，水辣蓼具有抗微生物、殺蟲、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性［2～5］。水辣蓼中主要含有揮發(fā)油、黃酮及黃酮苷類化合物［5］。曾有文獻(xiàn)報(bào)道用蘆丁作為對照品控制水辣蓼的質(zhì)量［6］，在《中華本草》中是以槲皮素作為水辣蓼的薄層對照［7］。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分為其抗氧化活性的有效成分［2］。為此，本研究首次用高效液相色譜法建立了同時(shí)測定水辣蓼中2種黃酮類成分槲皮素和槲皮苷的含量測定，為該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國Waters公司):600泵;PDA紫外檢測器。試劑:色譜乙腈(Burdick＆Jackon);重蒸水;其余試劑均為分析純。槲皮苷、槲皮素對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，槲皮素批號:1-9905，槲皮苷批號:111538-200403。

樣品:10批海南產(chǎn)水辣蓼樣品分別采自海南文昌、屯昌，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所助理研究員李榕濤鑒定為蓼科植物水辣蓼Polygonum hydropiper Linn.的全草。

2 含量測定

2.1 色譜條件 VertiSep GES C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱;流動相:乙腈-甲酸水(0.1%，V/V)(19∶81)等度洗脫。流速:1 ml/min;檢測波長: 350 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μl;色譜分離見圖1。

圖1 槲皮苷、槲皮素對照品(A)和水辣蓼藥材(B)HPLC色譜圖

2.2 實(shí)驗(yàn)方法及方法學(xué)考察

2.2.1 供試品溶液的制備 取水辣蓼藥材粉末(過四號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，回流1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，精密稱定，蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移到10 ml容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液1 ml即得。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取槲皮苷對照品19.56 mg，槲皮素對照品32.18 mg，甲醇定容于10 ml量瓶中，作為對照品儲備溶液。

2.2.3 線性及定量限的測定 精密稱取適量槲皮苷對照品儲備液配置成 2.934、9.780、24.450、29.340、48.900 μg/ml，精密稱取適量槲皮素對照品儲備液配置成4.827 、16.091 、40.228 、48.273 、80.455 μg/ml，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y=23 803X+21 433，r=0.999 7;Y=30 366X+64 581，r=0.999 9。結(jié)果表明:槲皮苷在2.934 ～48.900 μg/ml，槲皮素在 4.827～80.455 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材粉末5份(編號4)，按供試品溶液制備方法，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，記錄峰面積，槲皮苷和槲皮素含量分別為0.185 5%、0.304 1%;RSD分別為0.21%、0.17%。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液(29.340 μg/ml)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得峰面積，槲皮苷和槲皮素對照品日間精密度RSD分別為1.68%、1.87%，日內(nèi)精密度RSD分別為1.2%、1.3%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在0、4、8、24、48 h分別按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果表明供試品在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定，槲皮苷和槲皮素對照品峰面積RSD分別為1.2%、0.76%。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 精取同一已知含量的水辣蓼分別置9個(gè)三角瓶中，每三份一組，按樣品中槲皮苷和槲皮素含量的120%、100%、80%分別加入適量槲皮苷和槲皮素對照品溶液，然后按供試品溶液制備方法制備，測定結(jié)果，槲皮苷和槲皮素對照品平均加樣回收率分別為98.29%、97.98%;RSD分別為1.84%、1.91%。

2.2.8 樣品測定 取10批水辣蓼藥材粉末，按供試品溶液制備方法制備樣品，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 水辣蓼藥材中槲皮苷、槲皮素含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 對照品的選擇 蘆丁在一半以上的高等植物中都存在，不足以作為衡量水辣蓼藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，另外槲皮苷抗氧化活性比槲皮素強(qiáng)，因此我們選擇槲皮素、槲皮苷為對照品，作為水辣蓼的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，從而可以更加全面的反映水辣蓼藥材質(zhì)量。

3.2 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)曾分別用二氯甲烷、70%乙醇和甲醇作為提取溶劑，超聲提取水辣蓼藥材中槲皮素和槲皮苷的含量，HPLC測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取物中槲皮素和槲皮苷的含量最高。并對甲醇超聲提取和回流提取方式及提取次數(shù)進(jìn)行了考察，最后確定提取方法為甲醇回流提取1 h作為供試品溶液的提取方法。

［1］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:896.

［2］Yagi A，Uemura T，Okamura N，et al.Antioxidative sulphated flavonoids in leaves of Polygonum hydropiper［J］.Phytochemistry，1994，35(4):885.

［3］Haraguchi H，Hashimoto K，Yagi A.Antioxidative substances in leaves of Polygonum hydropiper［J］.J Agric Food Chem，1992，40(8):1349.

［4］Haraguchi H，Ohmi I，Sakai S，et al.Effect of Polygonum hydropiper flavonoids on lens aldose reductase and related enzymes［J］.J Nat Prod，1996，59(4):443.

［5］鞏忠福，楊國林，嚴(yán)作廷，等.蓼屬植物的化學(xué)成分與藥理學(xué)活性研究進(jìn)展［J］.中草藥，2002，33(1):82.

［6］羅 杰，陸 霞.HPLC法測定水辣蓼中蘆丁的含量［J］.中草藥，2004，35(3):285.

［7］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草第6卷［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:662.