谷朊粉的有限酶解對其分散性及膠黏性的影響

王章存，陸 杰，2，李樂靜，崔勝文

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.江蘇省泰州市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇泰州225300）

谷朊粉的有限酶解對其分散性及膠黏性的影響

王章存1，陸 杰1，2，李樂靜1，崔勝文1

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.江蘇省泰州市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇泰州225300）

為了改善谷朊粉在水溶液中的物化性能，利用堿性蛋白酶對谷朊粉進行了有限水解。通過單因素實驗，分析了底物濃度、反應溫度、加酶量和反應時間對其分散穩(wěn)定性、膠黏性的影響，并分析了酶解物中的蛋白質分子粒徑。通過正交實驗確定了以提高谷朊粉分散特性和膠黏性為目的的最佳酶解條件為：底物濃度0.30g/mL、溫度50℃、加酶量0.50%、反應時間20min，此時可使谷朊粉的相對分散穩(wěn)定性達到96.3%，黏度為3.2mPa·s，蛋白質平均分子粒徑604.6nm。分析顯示，不同酶解樣品分散穩(wěn)定性、黏度和蛋白質平均分子粒徑三種指標之間的變化趨勢并不完全一致。

谷朊粉，有限酶解，分散穩(wěn)定性，膠黏性，蛋白質粒徑

谷朊粉是小麥淀粉生產(chǎn)的一種副產(chǎn)品，主要由麥谷蛋白以及麥醇溶蛋白組成，具有優(yōu)良的黏彈性、薄膜成型性、吸脂乳化性等，對小麥面粉食品的加工品質有重要的影響[1-3]。但是，谷朊粉中的蛋白質都是大分子，且含有較多的疏水性氨基酸[4]，在水中的溶解性和分散性很差，無法與溶液中的其他成分形成均勻的體系，限制了它作為食品配料在食品工業(yè)尤其是流體食品加工中的應用范圍。因此，谷朊粉的改性已成為小麥蛋白深加工研究的一個熱點，其中，酶法改性應用最為廣泛，通過酶解作用將大分子的谷朊粉蛋白質降解，提高其在水中的溶解性、乳化性和起泡性等功能性[5-7]。但是，目前文獻中對谷朊粉酶解物的溶解性、乳化性和起泡性等功能性質的分析往往局限于酶解后離心處理得到的可溶性部分[8-11]。這些研究有諸多弊端，一是產(chǎn)物的得率（即酶解可溶性部分與原料的比率）低，影響在實際生產(chǎn)中的應用；二是可溶部分大多是小分子蛋白質和小肽，影響其乳化性、起泡性、黏彈性等，因為大分子蛋白質才具有這樣的功能性質。目前文獻對谷朊粉流變學的分析主要是谷朊粉加入少量水后在固體或半固體狀態(tài)下的結果，在水溶液中谷朊粉只在局部聚集形成面筋團[12-15]。實際上，谷朊粉經(jīng)過有限酶解后只要在水中有較好的分散性即可大大拓展它的用途，如用于豆腐、火腿腸等凝膠型和蛋白飲料等液體型食品的開發(fā)，也可用于可降解性食品包裝材料蛋白膜中。因此，本實驗根據(jù)谷朊粉的實際應用特點，首次提出以酶解產(chǎn)物的分散特性為主要評價指標、兼顧其膠黏性、分子粒徑等指標，研究堿性蛋白酶有限酶解對谷朊粉上述指標的影響，以期既改善谷朊粉在食品加工中的功能性質，又能大大提高谷朊粉酶解物的產(chǎn)品得率（注：本實驗谷朊粉酶解后不離心直接用于性能分析，故產(chǎn)品得率為100%）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 蛋白質含量80.6%（W/W），鄭州新威營養(yǎng)科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L） 諾維信公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市光復科技發(fā)展有限公司；鹽酸（分析純） 開封市芳晶化學試劑有限公司。

868型酸度計 上海熱電儀器有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 江蘇金壇正基儀器有限公司；FA1004電子天平 上海上平儀器有限公司；TDA型電子恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；NDJ-7型旋轉式粘度計 上海安德儀器設備有限公司；UV-2100型紫外可見光分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；Zeta-Plus激光粒度儀 美國BrookHaven公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 谷朊粉酶解物的制備 在酶反應器中，將蒸餾水加熱至設定的溫度，攪拌條件下，將谷朊粉加入其中，制成一定濃度的蛋白質懸浮液，調節(jié)設定pH后，恒溫攪拌，使谷朊粉充分溶脹，將蛋白酶按一定比例加入懸浮液中（各單因素實驗時的具體酶解條件見結果與分析部分），開始計時，振蕩并保持恒溫，酶解過程中不斷用氫氧化鈉（1.0mol/L）滴定維持溶液pH恒定。水解結束后，調節(jié)pH至中性，于沸水浴中加熱10min使酶失活，冷卻，即得谷朊粉酶解物。

1.2.2 酶解物分散性測定 取一定量的酶解物，稀釋至體積為100mL、濃度1.0mg/mL后，于分光光度計中280nm處測定其吸光值（A），記錄10min內吸光值的變化。最大值（Amax）、最小值（Amin）的相對大小可以反映酶解物中蛋白質分子沉降情況，即分散特性，二者的比值則反映酶解物的分散穩(wěn)定性。實驗重復3次，取平均值。酶解物初始吸光度值即為最大值，隨著蛋白分子沉降，吸光度值會有所降低，沉降越慢，吸光度值降低越少，分散越穩(wěn)定。所以，根據(jù)以上蛋白沉降與光吸收值關系可將酶解物分散穩(wěn)定性定義為：

1.2.3 酶解物黏度測定 將不同酶解條件下的樣品用水稀釋至體積為200mL濃度均為0.1g/mL后，采用旋轉粘度計測定溶液的黏度（η），每組樣品重復測定3次，取其平均值。

1.2.4 酶解物蛋白質分子粒徑測定[16]取一定量不同酶解條件下的酶解物樣品，稀釋至體積為100mL、濃度為0.50mg/mL后，于Zeta-Plus激光粒度儀中測定其粒徑大小分布和比例，以平均粒徑表示酶解物蛋白分子粒徑大小。平均粒徑=∑（粒徑大小×該粒徑所占比例）/∑粒徑所占比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理。

2 結果與分析

2.1 谷朊粉濃度對酶解物性質的影響

分別配制不同底物濃度0.10～0.30g/mL的谷朊粉懸浮液500mL進行酶解，酶解溫度50℃，加酶量E/S為0.50%，pH8.5，酶解時間10min。反應結束后，分別取樣稀釋至規(guī)定濃度后，測定不同樣品的分散性和分散穩(wěn)定性、黏度及蛋白質分子粒徑，結果如圖1所示。

圖1 底物濃度對酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.1 Effect of gluten concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

研究發(fā)現(xiàn)，在不同底物濃度下酶解產(chǎn)物的分散性差別不大，但隨著底物濃度的增加，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性及黏度都有所提高，當?shù)孜餄舛瘸^0.25g/mL后，上述指標增加幅度有所減緩，底物濃度達0.30g/mL時上述指標增長趨于平緩（圖1a）。這可能與谷朊粉酶解時蛋白質分子的變化有關。谷朊粉經(jīng)過適當酶解后，蛋白質大分子變?yōu)橄鄬^小的分子，在水中的分散性增加，同時也表現(xiàn)出一定的黏性。低濃度酶解物的分散穩(wěn)定性較低，可能與其分子不均一性有關；而在較高底物濃度水解時，蛋白質分子被降解的程度較低且分子大小較為均勻，蛋白質分子之間更容易粘連，溶液膠黏性和分散穩(wěn)定性較高。用激光粒度儀測定結果也表明，高濃度酶解后蛋白質分子的平均粒徑大于低濃度時的平均粒徑（圖1b），且低濃度酶解的產(chǎn)物中分子大小離散度較大。因此，確定最適的底物濃度為0.30g/mL。

2.2 酶解時間對酶解物性質的影響

配制谷朊粉濃度0.30g/mL溶液500mL，酶解溫度50℃，加酶量為0.50%和pH8.5時，測定不同酶解時間（10、20、30、40、50min）后的酶解物的分散特性、黏度及蛋白質分子粒徑。結果表明，隨著酶解時間的增加，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性呈上升趨勢，而黏度呈下降趨勢（圖2a）。這可能是酶解時間越長，蛋白分子越小，在水中分散性較好，呈溶解狀態(tài)而不容易沉淀。但是，小蛋白分子之間不易膠粘，溶液黏度會大大下降。從粒徑分析的結果（圖2b）也可以看出，隨著酶解時間延長，酶解物中蛋白分子的平均粒徑也不斷下降。雖然隨著酶解時間的延長，分散性會略有提高，但相差并不是很大，而膠黏性卻下降很多，不利于谷朊粉酶解產(chǎn)物的進一步應用。因此，確定最適的酶解時間為10min。

圖2 酶解時間對酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.3 加酶量對酶解物性質的影響

配制500mL谷朊粉濃度為0.30g/mL溶液，在酶解溫度50℃，pH8.5和酶解時間10min條件下，考察不同加酶量水解對谷朊粉分散特性、黏度及其蛋白質分子粒徑的影響，結果如圖3所示?？梢钥闯觯S著加酶量的提高，谷朊粉酶解物的分散穩(wěn)定性略有提高，而黏度卻不斷下降?？赡苁窃黾用赣昧渴沟玫鞍姿獾酶鼮槌浞?，蛋白顆粒變小，粒徑分析的結果（圖3b）也證明了這一點。另外，增加酶用量還會干擾酶解液的組成且大大增加成本，而加酶量小于0.50%時谷朊粉蛋白質分子幾乎無法在水中分散，也無法測定其黏度，因此，確定最適的加酶量為0.50%。

2.4 酶解溫度對酶解物性質的影響

配制500mL谷朊粉濃度為0.30g/mL溶液，在加酶量為0.50%，pH8.5和酶解時間10min條件下，測定不同的酶解溫度下樣品的分散特性、黏度及蛋白質分子粒徑。結果表明，溫度在40～50℃之間時，隨著溫度的升高，酶解物的分散穩(wěn)定性及黏度呈上升趨勢；溫度高于50℃時，隨著溫度的升高，酶解物的分散穩(wěn)定性幾乎不變，而黏度呈下降趨勢（圖4）。這可能是溫度低于50℃時，酶的活性較低，蛋白不能充分酶解，無法在水中很好地分散形成穩(wěn)定懸浮液；溫度高于50℃時，隨著溫度的升高酶的活性有所提高，但蛋白質分子只是略微變小，所以酶解物分散穩(wěn)定性幾乎不變，而黏度略微下降。粒徑分析結果與此分析也相吻合（圖4b）。此外，溫度高于60℃時，堿性酶會因溫度過高而逐漸失活，同時還會引起蛋白結團，不易形成穩(wěn)定的分散懸浮液，也不利于酶解反應。因此，確定最適的酶解溫度為50℃。

圖3 加酶量對酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

圖4 酶解溫度對酶解物性能和分子粒徑的影響Fig.4 Effect of the temperature on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.5 堿性蛋白酶水解谷朊粉條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗可知，在堿性蛋白酶水解谷朊粉的反應中，影響因素主要有時間、溫度、加酶量以及底物濃度，為了得到分散性能較好、黏度較高的酶解物，在上述單因素實驗的基礎上，采用L9（34）正交實驗對堿性蛋白酶水解谷朊粉的條件進行優(yōu)化，反應液體積為500mL。實驗結果如表1所示。

表1 正交實驗方案及結果Table 1 Results of orthogonal test for enzymolysis of wheat gluten

由極差分析可以看出，4個因素對谷朊粉分散性影響的主次順序為：Dgt;Bgt;Cgt;A，即底物濃度gt;反應溫度gt;加酶量gt;反應時間，最優(yōu)組合為A3B2C1D3，與正交表中的第8組實驗一致，此最佳條件下谷朊粉分散性為98.5%，黏度為2.8mPa·s。4個因素對谷朊粉膠黏性影響的主次順序為：Dgt;Cgt;Agt;B，最優(yōu)組合為A1B2C1D3，這個組合并未出現(xiàn)在正交表中，按此優(yōu)化條件安排實驗，結果為谷朊粉分散性為92.6%，黏度為3.4mPa·s?？梢钥闯觯瑑山M的最佳溫度（50℃）、加酶量（0.50%）及底物濃度（0.30g/mL）都相同，只是酶解時間有所區(qū)別。酶解時間較長，酶解物分散性較好，但蛋白顆粒較小，黏度會大大下降，并不利于谷朊粉進一步在生產(chǎn)中的應用，縮短酶解時間可提高谷朊粉黏度，同時對其分散性影響并不大，仍能維持在90%以上。因此，綜合考慮對谷朊粉分散性及黏度的影響，確定最佳酶解條件為A2B2C1D3，即時間20min，溫度50℃，加酶量0.50%，底物濃度0.30g/mL。此時谷朊粉分散性為96.3%，粘度為3.2mPa·s，均達到較高水平，蛋白質分子平均粒徑也達到了604.6nm，高于正交實驗中各組實驗的結果，證明分析所得的最佳酶解條件是可靠的。

為了進一步考察不同酶解樣品的分散穩(wěn)定性、黏度和分子粒徑之間的關系，將其三種指標的分析結果列于圖5?？梢钥闯?，樣品中蛋白質平均分子粒徑和黏度并不是隨著分散穩(wěn)定性的增大而持續(xù)增加；平均分子粒徑與黏度的變化趨勢雖然相似，但在具有不同分散穩(wěn)定性樣品中，二者的變化幅度并不相同，說明酶解物的分散穩(wěn)定性和黏度需要不同的蛋白質分子特征。

圖5 谷朊粉酶解物分散穩(wěn)定性、黏度和分子粒徑之間的相關性Fig.5 Relationship between disperse stationarity，viscosity and average size of the hydrolysates

3 結論

3.1 本實驗首次研究了以改善谷朊粉的分散性能和膠黏性為目的的酶解條件，在單因素分析的基礎上，采用正交實驗優(yōu)化的結果為：底物濃度0.30g/mL，溫度50℃，加酶量0.50%，反應時間20min，在此條件下得出的谷朊粉酶解物分散穩(wěn)定性為96.3%，黏度達到了3.2mPa·s，得到了較滿意的效果。

3.2 對谷朊粉酶解物粒徑分布及分散性能、膠黏性能關系的分析表明，蛋白質平均分子粒徑和黏度并不是隨著分散穩(wěn)定性的增大而持續(xù)增加，三種指標之間的變化程度并不完全一致。

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Effect of limited enzymatic hydrolysis on dispersity and viscosity of wheat gluten

WANG Zhang-cun1，LU Jie1，2，LI Le-jing1，CUI Sheng-wen1
（1.School of Food＆Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Product Quality Supervising and Inspecting Institute of Taizhou City，Taizhou 225300，China）

Wheat gluten was limited hydrolyzed by Alcalase to improve its physical and chemical properties.The effects of hydrolysis conditions such as gluten concentration，reaction temperature，enzyme-gluten ratio and reaction time on the dispersity stationarity and viscosity of wheat gluten hydrolysates were researched first with the single factor experiment.The protein molecular partical size of the hydrolysates was also determined.And then，the optimized condition of the proteolysis was carried out by orthogonal experiment as the following：gluten concentration was 0.30g/mL，temperature was 50℃，enzyme-substrate ratio was 0.50%and hydrolysis time was 20min.According to the condition，the dispersity stationarity of the hydrolysates achieved 96.3%，viscosity was 3.2mPa·s，protein molecular size was 604.6nm.The variation trend of dispersity stationarity，viscosity and the molecular size of the hydrolysates were not synchronization.

wheat gluten；limited enzymolysis；dispersity stationarity；viscosity；protein partical size

TS239

A

1002-0306（2012）05-0119-05

2010－12－28

王章存（1963－），男，教授，博士，主要從事糧油植物蛋白和食品生物技術研究。

鄭州輕工業(yè)學院博士基金項目（2007BJ0016）。