黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜研究

高學(xué)玲，賀曼曼，岳鵬翔，鄒敏亮，查芳芳

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽黃山245700）

黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜研究

高學(xué)玲1，賀曼曼1，岳鵬翔1，鄒敏亮2，*，查芳芳1

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽黃山245700）

為建立黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜分析方法，采用GC-MS檢測法并運(yùn)用指紋圖譜相似度評價軟件對其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，采用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（0.25mm×30m×0.25μm），設(shè)置進(jìn)樣口溫度為260℃，載氣為高純氦氣，流速1.0mL·min-1，分流比為25∶1，進(jìn)樣量2μL的條件，以程序升溫對10批黃山貢菊揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，標(biāo)定了黃山貢菊揮發(fā)油的59個共有峰為特征峰，初步建立了以59個共有峰為特征指紋信息的GC-MS指紋圖譜，10批樣品相似度均大于0.9；質(zhì)譜鑒定出黃山貢菊揮發(fā)油含量最高成分為Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate，約占總量的20%。此分析方法精密度高、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好，揮發(fā)油中各成分分離效果較好，所建立的指紋圖譜可為黃山貢菊質(zhì)量控制提供參考，且上述含量最高的成分可作為黃山貢菊指標(biāo)性成分之一來控制黃山貢菊質(zhì)量的穩(wěn)定性。

黃山貢菊，揮發(fā)油，氣-質(zhì)聯(lián)用儀，指紋圖譜

菊花（Floschrysanthemi） 為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的頭狀花序，多年生草本植物，隨品種及產(chǎn)地不同分為貢菊、杭菊、亳菊、滁菊、懷菊、濟(jì)菊等。黃山貢菊是主產(chǎn)黃山歙縣金竹嶺地區(qū)的地道藥材，具有味甘苦、性微寒、疏風(fēng)清熱、平肝明目、解毒消腫的功效，主治風(fēng)熱感冒、發(fā)熱頭痛、眩暈、目赤腫痛、疔瘡腫痛等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃山貢菊含有黃酮類、綠原酸、木犀草素以及揮發(fā)性成分等[2-3]，具有抗菌、抗氧化、解熱、降壓、抑制突變、抗癌等作用[4-9]。黃山貢菊作為中國藥典收藏的四大藥菊之一，品質(zhì)優(yōu)良，集色、香、味、型于一體，既有觀賞價值，又有藥用功能，被譽(yù)為藥用和飲中之佳品。近些年，由于黃山貢菊市場價格較高，很多商人用當(dāng)?shù)厮a(chǎn)七月菊充當(dāng)黃山貢菊，從而對黃山貢菊的質(zhì)量穩(wěn)定帶來了極大影響。目前對黃山貢菊的鑒定及品質(zhì)評價多依賴于感官審評，還缺乏必要的理論依據(jù)。指紋圖譜是現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制的重要手段之一，目前，關(guān)于菊花揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜研究，僅見少量文獻(xiàn)報道[10-11]，尚未見到關(guān)于黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的研究報道。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄XD“揮發(fā)油測定法”項下甲法提取菊花中揮發(fā)油方法，運(yùn)用GC-MS法對其揮發(fā)油指紋圖譜進(jìn)行研究，以期為黃山貢菊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及品質(zhì)控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃山貢菊 黃山歙縣雅氏貢菊廠提供，由安徽歙縣農(nóng)業(yè)委員會畢小衛(wèi)主任鑒定，樣品來源信息見表1；龍腦（純度99.2%）、樟腦（純度≥96%） 中國藥品生物制品檢定所；正己烷 分析純，青島匯和化工。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 7890-5975C型，美國安捷倫有限公司；電子天平 AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司。

表1 菊花樣品來源信息Table 1 Sources of Flos chrysanthemi samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 GC：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（0.25mm× 30m×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：260℃；升溫程序：初始溫度80℃，以2℃·min-1升至100℃保持20min，再以1℃·min-1升至135℃，再以5℃·min-1升至250℃，保持10min；載氣為高純氦氣，流速1.0mL·min-1；恒流，分流比：25∶1；進(jìn)樣量：2μL。MS：EI源（70eV），雙燈絲，離子源溫度230℃；四極桿溫度：150℃；溶劑延時3min；質(zhì)量范圍m/z：50～500全程掃描。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取龍腦8.6mg，樟腦13.0mg，分別用正己烷定容至10mL容量瓶中；各吸0.1mL，加正己烷1.8mL，配成43、68mg/L的混標(biāo)溶液。

1.2.3 供試品制備 供試樣粉碎后（過24目），精密稱取100g，1200mL超純水裝入5000mL圓底燒瓶，連接揮發(fā)油測定儀，接上冷凝管，自冷凝管上端加水至溢入圓底燒瓶，電爐上加熱保持微沸6h，停止加熱，靜置分層后，用2mL正己烷收集揮發(fā)油，濾頭過濾后上機(jī)檢測。

1.2.4 方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn)（取同一份供試樣，連續(xù)進(jìn)樣6次）；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（取同一份供試樣，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣）；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（稱取同一份樣6份，分別在同樣條件下提取進(jìn)樣分析），以樟腦峰為參照物，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果表明各特征峰的相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積RSD小于5%，符合指紋圖譜要求。

2.2 指紋圖譜的建立及分析

以安徽歙縣金竹嶺地區(qū)所產(chǎn)的黃山貢菊為研究對象，對10批藥材的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，10批樣品揮發(fā)油的GC-MS疊加圖譜見圖1。由圖1可知，黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS色譜可分離100多個峰，將10批黃山貢菊的指紋圖譜進(jìn)行匹配，結(jié)果有59個共有特征峰（占總峰面積的約90%），以樟腦峰為參照峰，分別求出各特征峰的調(diào)整保留時間之比及相對峰面積，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，通過NIST2008標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索，標(biāo)準(zhǔn)品對照，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了45個共有峰，其結(jié)果見表2。

圖1 10批黃山貢菊GC-MS色譜指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprints of ten batches of Gongju

根據(jù)表2標(biāo)定20個已鑒定出相對含量較高的峰為較強(qiáng)峰，分別為：峰1、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11、峰12、峰13、峰14、峰15、峰17、峰18、峰25、峰27、峰38、峰39、峰58，此外還有常見報道的峰3、峰4；其余的為次強(qiáng)峰。由譜圖及以上數(shù)據(jù)可以看出較強(qiáng)峰大部分在60min以前出現(xiàn)，出峰時間較穩(wěn)定且相對含量較高，約占總共有峰面積的80%左右，分離效果較好，可體現(xiàn)黃山貢菊的特有香氣，其中峰6為突出指標(biāo)；次強(qiáng)峰的相對含量較小，分離度次于較強(qiáng)峰；對于未鑒定出的其它共有未知峰還有待于進(jìn)一步研究確定。從相對峰面積可以看出，不同批次樣品同一色譜峰存在差異，這可能與單批藥材的具體產(chǎn)地及炮制工藝等有關(guān)。

由表2可知，黃山貢菊的香氣類成分主體上屬于萜稀類，如Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate、乙酸冰片酯、β-欖香稀、石竹烯、金合歡稀、大牦牛兒稀D、芳-香姜黃稀、姜倍半萜、紅沒藥烯、倍半水芹稀、匙葉桉油稀醇、石竹稀氧化物、樟腦、龍腦等。

2.3 指紋圖譜相似度分析

表2 10批次黃山貢菊揮發(fā)油特征峰相對含量Table 2 Relative area of common peaks in ten batches of Gongju

對10批黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS圖譜進(jìn)行相似度分析，并以第1批黃山貢菊揮發(fā)油的圖譜作為參照譜圖，將10批黃山貢菊揮發(fā)油圖譜作為代表性圖譜生成共有模式見圖2，計算10批黃山貢菊及其他品種菊花與共有模式之間的相似度，結(jié)果見表3。

續(xù)表

圖2 黃山貢菊揮發(fā)油共有峰指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of common peaks of Gongju essential oil

表3 與共有模式比較的各樣品相似度評價Table 3 Evaluation of similarity of Gongju

由表3可以看出，10批黃山貢菊的相似度均在0.9以上，符合國家藥品監(jiān)督管理局對指紋圖譜相似度要求。在相同提取及色譜條件下，將其它種類菊花揮發(fā)油圖譜與黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于產(chǎn)地、氣候、土壤條件、炮制工藝及品種的不同，其揮發(fā)油成分與黃山貢菊差異較大，因此此方法可將黃山貢菊與其他種類菊花區(qū)別開，從而有效保證黃山貢菊的質(zhì)量穩(wěn)定。

3 結(jié)論

利用GC-MS分析黃山貢菊揮發(fā)油成分，標(biāo)定了59個共有峰構(gòu)成黃山貢菊揮發(fā)油特征峰指紋圖譜，其峰面積占總峰面積約90%，符合指紋圖譜的要求。

黃山貢菊揮發(fā)油成分與其它地區(qū)不同品種菊花揮發(fā)油成分有一定的差別，黃山貢菊揮發(fā)油中含量最高的成分是Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethylaceate，約占20%，其它地區(qū)貢菊及其它品種菊花中該揮發(fā)油成分含量則較低（10%以下），因此，Bicyclo[3.1.1] hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate可作為黃山貢菊指標(biāo)性成分之一來控制黃山貢菊質(zhì)量的穩(wěn)定性。

指紋圖譜是國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的有效手段之一，本文通過氣質(zhì)聯(lián)用色譜法建立了黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜，對揮發(fā)油的主要成分進(jìn)行了分析鑒定，為黃山貢菊的質(zhì)量評價和后期的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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GC-MS fingerprint analysis of volatile oil in Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City

GAO Xue-ling1，HE Man-man1，YUE Peng-xiang1，ZOU Min-liang2，*，ZHA Fang-fang1
（1.School of Tea and Food Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.Huangshan Tianjian Agricultural Sci-Tech Ltd.，Huangshan 245700，China）

To establish a method of fingerprint analysis on Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City by using GC-MS and computer aided similarity evaluation.The results showed that the optimum condition of GC-MS was applied with a fiber column（0.25mm×30m×0.25μm）coated with HP-5MS.The temperature at feed inlet was 260℃，the carrier gas was nitrogen，the flow rate was 1.0mL·min-1，the split ratio was 25∶1，and the sample size was 2μL.The essential oil in ten batches of Gongju was analyzed by adopting temperature programmer.In this condition，59 common peaks were identified and GC-MS fingerprint of 59 common peaks was established preliminarily.The correlation coefficients of ten batches of Gongju were higher than 0.9.The content of Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate in volatile oil of Gongju was the highest（20%）. The method is of high degree of precision，reproducibility，and stability.The separating degree of each component in the essential oil is good.Both the established fingerprints and the component of Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate could be used as the quality control index for Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City.

Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City；essential oil；GC-MS；fingerprint

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0067-05

2011－03－02 *通訊聯(lián)系人

高學(xué)玲（1967-），女，副教授，主要從事食品及農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

國家星火計劃項目（2010GA710027）。