微藻DHA油脂的酶法脫膠工藝研究

陳園力，胡耀池，龔東平，梁井瑞，蔣 露，張紅漫，*

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實驗室，江蘇南京210009；2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京210009）

微藻DHA油脂的酶法脫膠工藝研究

陳園力1，胡耀池1，龔東平1，梁井瑞2，蔣 露2，張紅漫2，*

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實驗室，江蘇南京210009；2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京210009）

采用嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）產(chǎn)磷脂酶A1對裂殖壺菌產(chǎn)DHA毛油進(jìn)行脫膠處理，以脫膠油磷含量、酸價為考查指標(biāo)，先對脫膠時間、反應(yīng)溫度、加酶量和加水量等因素進(jìn)行單因素實驗，然后通過正交實驗得出微藻DHA油脂的最佳脫膠條件為：脫膠時間3h，反應(yīng)溫度45℃，加酶量0.6mL/100g油，加水量為2mL/100g油；此條件下油脂中磷脂含量從158.1mg/kg降到4.6mg/kg，酸價變化較小。與傳統(tǒng)的脫膠工藝相比，新型酶法脫膠優(yōu)勢明顯，具有良好的應(yīng)用前景。

磷脂酶A1，酶法脫膠，DHA油脂

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）是一種重要的ω-3型長鏈多不飽和脂肪酸，具有增強(qiáng)記憶、提高智力、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多重生理功效，具有“腦黃金”之稱[1-2]。微藻DHA油脂精煉通常分為脫膠、堿煉、脫色和脫臭四步工序，其中脫膠是整個油脂精煉工藝的基礎(chǔ)，主要作用是除去油脂中的磷脂等膠質(zhì)。脫膠效果不佳會導(dǎo)致精煉損耗大，加重脫色、脫臭的負(fù)擔(dān)[3]，對設(shè)備也會造成比較大的影響，造成過濾困難、設(shè)備結(jié)焦和增加白土的消耗等，同時還會造成精油易酸敗和回色現(xiàn)象[4]。傳統(tǒng)的油脂脫膠工藝是水化脫膠與酸法脫膠相結(jié)合的化學(xué)脫膠方法，工藝流程相對簡單，但往往會造成磷脂脫除效果差、油脂損耗過多、產(chǎn)生廢水多、油脂品質(zhì)不穩(wěn)定等不良影響。新型酶法脫膠是一種高效、經(jīng)濟(jì)、無污染的脫膠方法[5]，它是利用微生物發(fā)酵提取的磷脂酶，催化磷脂水解，轉(zhuǎn)化為更容易水化的溶血磷脂，然后水化凝聚，將膠質(zhì)從油脂中分離出來[6]。相比傳統(tǒng)的油脂脫膠工藝，酶法脫膠工藝具有脫磷效果好、煉耗小、能耗低、產(chǎn)生污水少等優(yōu)點(diǎn)[7-8]，是油脂脫膠未來的主要發(fā)展趨勢之一。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DHA毛油 經(jīng)酶解菌體萃取所得，江蘇天凱生物科技有限公司；磷脂酶A1 由Thermomyces lanuginosus發(fā)酵生產(chǎn)，購自Novozymes公司；硫酸聯(lián)胺、磷酸二氫鉀、鉬酸鈉、氫氧化鉀、氧化鋅、檸檬酸等 均為市售分析純。

HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JJ-1增力電動攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；紫外/可見分光光度計 PerkinElmer公司；pH計 上海理達(dá)儀器廠；Centrifuge 5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；電子調(diào)溫電爐 江陰市保利科研器械有限公司；高溫箱形電爐 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油相pH的測定 向50mL離心管中加入15g毛油和15mL蒸餾水，充分混勻5min，4000r/min離心10min，棄去上層油相，取離心管中水相，使用pH計測定，經(jīng)校正后采用。油相pH為5左右的經(jīng)驗校正公式為：pH實際=pH測定-0.38[6]。

1.2.2 磷脂酶A1酶活的測定 磷脂酶A1的酶活采用以無油磷脂作為底物的酸堿滴定法測定[9]，測得酶活為9800U/mL。用pH≈5.0的Na2HPO4和檸檬酸緩沖液稀釋磷脂酶A1原酶液至50倍，待用。

1.2.3 酶法脫膠工藝流程 準(zhǔn)確稱取100g酶解毛油于250mL圓底燒瓶中，水浴預(yù)熱到80℃，加入1mL檸檬酸，在80℃下機(jī)械攪拌30min后，將溫度設(shè)置為30～60℃，用NaOH溶液調(diào)節(jié)油相的pH為5.0左右，加入一定量的酶液和蒸餾水，固定轉(zhuǎn)速下攪拌一定時間后，離心分離。取上層油相測定磷含量及酸價。

1.2.4 磷含量分析 為實現(xiàn)油相與膠質(zhì)的有效分離，脫膠后的油樣水浴至80℃，保溫5min后，在10000r/min離心10min后，取上層油樣10g左右（精確到0.01g）進(jìn)行磷含量分析。油脂中磷含量分析參照GB 5537-2008進(jìn)行。1.2.5 酸價測定 準(zhǔn)確稱取3.0～5.0g脫膠油，參照GB/T 5009.37-2003測定其酸價。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對脫膠效果的影響

固定反應(yīng)溫度為50℃，加酶量為0.5mL/100g油，加水量為2mL/100g油，pH≈5.0。分別設(shè)定脫膠時間為1、2、3、4h?？疾烀撃z時間對DHA油脂脫膠效果及其酸價的影響。得到脫膠時間與DHA油脂磷含量及酸價的變化關(guān)系如圖1所示。

圖1 反應(yīng)時間對脫膠效果及酸價的影響Fig.1 Reacting time on degumming effect and acid value

由圖1可知，磷含量在開始反應(yīng)后迅速下降，這是由于油脂中的磷脂多為水化磷脂較易水化除去[10]，隨著反應(yīng)時間的增加，脫膠油中的磷脂含量不斷降低，但下降幅度趨緩，當(dāng)反應(yīng)時間到達(dá)3h時，脫膠油中的磷含量僅為7.4mg/kg；脫膠油酸價較毛油呈上升趨勢，這是因為隨著反應(yīng)時間的延長，磷脂酶水解磷脂生成的游離脂肪酸增多，導(dǎo)致酸價上升，與磷含量變化趨勢相反。結(jié)合脫膠效果和節(jié)能綜合考慮，酶法脫膠反應(yīng)時間為3h。

2.2 溫度對脫膠效果的影響

固定反應(yīng)時間為3h，加酶量0.5mL/100g油，加水量為2mL/100g油，pH約為5.0，溫度分別設(shè)定為30、40、50、60℃?？疾旆磻?yīng)溫度對酶法脫膠效果及酸價的影響，得到反應(yīng)溫度與DHA脫膠油中磷含量及酸價的關(guān)系如圖2。

圖2 脫膠溫度對酶法脫膠及酸價的影響Fig.2 Reaction temperature on degumming effect and acid value

從圖2可知：磷脂酶A1是一種耐熱型酶，在60℃時仍具有活性，但是活性比在40～50℃時低，這是因為磷脂酶A1是一種蛋白質(zhì)類水解酶，在較高溫度下會出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性失活的現(xiàn)象，導(dǎo)致活性降低[6]。溫度在30℃時，沒有到達(dá)酶的最適溫度，活性較低，脫膠油中的磷含量較高。反應(yīng)溫度為40～50℃時，磷脂酶A1活性較高，脫膠油中的磷含量較低，此溫度下磷脂被水解產(chǎn)生的游離脂肪酸較多，因此酸價較高，而反應(yīng)溫度為60℃時，磷脂酶A1部分失活導(dǎo)致活性降低，磷脂水解產(chǎn)生的游離脂肪酸減少，脫膠油的酸價也降低到0.7mg/g。由此可見，酶法脫膠的最適溫度在40～50℃之間，有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 加水量對酶法脫膠的影響

在固定反應(yīng)時間為3h，溫度為50℃，加酶量為0.5mL/100g油，pH約為5.0的條件下，考察不同的加水量對微藻DHA油脂酶法脫膠效果及酸價的影響。分別設(shè)定加水量為1、3、5、7mL/100g，反應(yīng)結(jié)束后，測定微藻DHA脫膠油的磷含量和酸價，所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 加水量對脫膠油磷含量及酸價的影響Fig.3 Water dosage on degumming effect and acid value

DHA油脂中的磷脂在磷脂酶A1的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)樗苎字?，然后在水的作用下促使磷脂凝聚沉降。水量不足時，磷脂水化不完全，膠質(zhì)絮凝不好；水量過多時，則會形成水/油或油/水乳化現(xiàn)象，造成煉耗增加和分離困難等難題[11]。由圖3可知，當(dāng)加水量為3～7mL/100g油時，脫膠油中磷含量都在10mg/kg左右，加水量對脫膠油磷含量的變化影響不大。而脫膠油酸價呈增大的趨勢，這是因為油脂中含水量加大，會造成部分中性脂質(zhì)水解成游離脂肪酸[12]。綜合考慮，酶法DHA油脂脫膠的加水量為3mL/100g油。

2.4 加酶量對脫膠效果的影響

在固定反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為3h，加水量為2mL/100g油，pH約為5.0的條件下，分別取0.1、0.3、0.5、0.7mL酶稀釋液于100g毛油中進(jìn)行脫膠實驗，考察加酶量對脫膠油中磷含量及酸價的影響。所得結(jié)果如下圖所示。

圖4 加酶量對脫膠油磷含量及酸價的影響Fig.4 Enzyme dosage on degumming effect and acid value

從圖4可以看出，微藻DHA脫膠油的磷含量隨加酶量的增加呈不斷下降的趨勢，在加酶量為0.5mL/100g油之后，脫膠油中磷含量的下降并不明顯。脫膠油的酸價維持在0.7mg/g左右。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，酶法脫膠的加酶量為0.5mL/100g油較為合適。

2.5 正交實驗優(yōu)化最佳工藝條件

根據(jù)單因素對微藻DHA毛油酶法脫膠實驗的優(yōu)化結(jié)果，分別選定反應(yīng)時間、溫度、加酶量和加水量為自變量，各選定3個水平，由于單因素實驗中，脫膠油酸價與其磷含量呈負(fù)相關(guān)的變化，脫膠之后亦需堿煉步驟，故正交實驗只以脫膠油中磷含量作為考察指標(biāo)。選用L9（34）正交表安排正交實驗，毛油的pH始終維持在5.0左右。實驗安排及結(jié)果分析如下。

由實驗結(jié)果分析可知：各因素對脫膠油磷含量的影響大小次序為B＞A＞C＞D，即反應(yīng)溫度對實驗的影響最大，其次為反應(yīng)時間、加酶量和加水量，各因素的最佳水平組合為A3B2C3D2，即反應(yīng)時間3h，溫度45℃，加酶量0.6mL/100g油，加水量2mL/100g油。溫度對脫膠油中磷含量的影響主要體現(xiàn)在兩個方面，首先是溫度升高酶反應(yīng)速率加快，其次溫度過高也會使酶部分失活或是全部失活，結(jié)果表明溫度為45℃時，脫膠油中磷含量最低。脫膠油的磷含量隨反應(yīng)時間的延長有不斷下降的趨勢，但3h后，磷含量下降得并不顯著，因此最佳反應(yīng)時間為3h。加酶量的增加同樣會使脫膠油中磷含量不斷下降，當(dāng)加酶量為0.6mL/100g油時，磷含量降低不顯著。加水量對脫膠油磷含量并沒有明顯影響，加水量為2mL/100g油時，酶法脫膠效果較佳。

綜上所述，正交實驗得到的微藻DHA油脂脫膠的最佳工藝條件為：反應(yīng)時間3h，溫度45℃，加酶量0.6mL/100g油，加水量2mL/100g油，在此條件下脫膠油中的磷含量僅為4.6mg/kg。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

3 結(jié)論

磷脂酶A1應(yīng)用于微藻DHA油脂的酶法脫膠工藝具有比傳統(tǒng)脫膠工藝無法比擬的優(yōu)勢，是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保、高效穩(wěn)定的新型脫膠工藝。經(jīng)過優(yōu)化后的脫膠工藝，微藻DHA毛油中的磷含量由158.1mg/kg降低到4.6mg/kg，每100g毛油損耗8g左右，與傳統(tǒng)的脫膠工藝（每100g毛油損耗15～20g）相比，酶法脫膠損耗較小。此外，酶法脫膠得到的脫膠油與膠質(zhì)較易分離，得到的脫膠油較澄清。酶法脫膠較傳統(tǒng)水化脫膠工藝優(yōu)勢明顯，對高附加值的微生物油脂的精煉工藝改進(jìn)具有一定的參考價值和良好的應(yīng)用前景。

[1]Connor W E.Importance of n－3 fatty acids in health and disease[J].Am J Clin Nutr，2000，71：171S－175S.

[2]Horrocks L A，Yeo Y K.Health benefits of docosahexaenoic acid（DHA）[J].Pharmacol Res，1999，40：211－215.

[3]Marcia Pereira de Souza，Jose Carlos Cunha Petrus，Lireny A Guaraldo Goncalves，et al.Degumming of corn oil/hexane miscella using a ceramic membrane[J].Journal of Food Engineering，2008，86：557－564.

[4]Bo Yang，Yong－Hua Wang，Ji－Guo Yang.Optimization of enzymatic degumming process for rapeseed oil[J].JAOCS，2006，83：653－658.

[5]Dahlke K，H Buchold，E－M Münch，et al.First experiences with enzymatic oil refining[J].Inform，1995（6）：1284－1291.

[6]Kim C lausen.Enzymatic oil－degumming by a novel microbial phospholipase[J].Eur J Lipid Sci，Technol，2001，103：333－340.

[7]Mehran Jahani，M Alizadeh，M Pirozifard，et al.Optimization of enzymatic degumming process for rice bran oil using response surface methodology[J].Food Science and Technology，2008，41：1892-1898.

[8]Bruno H Winter，Kronelia Titze，Volker Marschner.Application of phospholipases in the edible oil industry[J].Lipid，1998，100：152-156.

[9]李脈，楊繼國，楊博.磷脂酶A1酶活測定方法的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（8）：80-82.

[10]吳可克，安慶大，江世德.酶促大豆油脫膠的研究[J].中國糧油學(xué)報，2004，19（2）：79-81.

[11]何東平.油脂精煉與加工工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[12]潘明喆，柴玉華，杜鵬.磷脂酶A1用于大豆油酶法脫膠技術(shù)的研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29（5）：219-221.

Study on enzyme catalyzed degumming of micro-algae DHA oil

CHEN Yuan-li1，HU Yao-chi1，GONG Dong-ping1，LIANG Jing-rui2，JIANG Lu2，ZHANG Hong-man2，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China；2.College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

Phospholipase A1 produced by Thermomyces lanuginosus was used for the DHA crude oil degumming which was fermented by Schizochytrium sp.Phosphorus content and acid value of the degumming oil was used as the indices.Firstly，the results of the reaction temperature and time，the dosage of adding water and enzyme was got through single factor test.Then through orthogonal test，the optimal conditions of microalgae DHA oil enzymatic degumming were determined as follows：reaction time 3h，reaction temperature 45℃，enzyme dosage 0.6mL/100g crude oil，water dosage 2mL/100g crude oil.Under this condition of degumming，the phosphorus content was reduced from 158.1mg/kg to 6.4mg/kg，and acid value changed slightly.Compared with the hydration degumming process，new enzymatic degumming has many obvious advantages and good application prospects.

phospholipase A1；enzymatic degumming；DHA oil

TS254.1

B

1002-0306（2012）01-0223-04

2011－01－05 *通訊聯(lián)系人

陳園力（1986-），男，在讀研究生，主要從事油脂精煉及改性方面的研究。

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（20936002）；江蘇省六大人才高峰項目（2008）；江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項目（2009）。