腌制酸菜中亞硝酸鹽降解菌的篩選及其降解特性研究

高小朋，蘇 青，程同培

（延安大學生命科學學院，陜西延安716000）

腌制酸菜中亞硝酸鹽降解菌的篩選及其降解特性研究

高小朋，蘇 青，程同培

（延安大學生命科學學院，陜西延安716000）

通過劃線分離、格里斯試劑比色法、紫外分光光度法測定，從陜北地區(qū)的酸菜水中篩選得到11株亞硝酸鹽降解菌，經(jīng)過測定，菌株SQ-4可以高效降解亞硝酸鹽，降解率可達97.60%。通過檢測硝酸鹽和VC含量可知，該菌株并未通過代謝活動將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽，同時產生了一定量的VC。

亞硝酸鹽，降解，菌株，VC

有研究表明，長期食用自制酸菜會導致食道癌和胃癌的發(fā)生，其原因主要是酸菜腌制過程中產生大量的亞硝酸鹽，使酸菜中的亞硝酸鹽含量超標[1]，過量的亞硝酸鹽能夠與胃內食物中的仲胺類物質相互作用，轉化為亞硝胺而引發(fā)癌癥[2]，更為嚴重的是，食入0.3～0.5g亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡[3-5]。陜北地區(qū)人民有常年食用自制酸菜的習慣，本實驗從陜北地區(qū)長期腌制酸菜的酸菜水中篩選出可以降解亞硝酸鹽的菌株，對酸菜中的亞硝酸鹽進行降解，并對實驗菌株改變酸菜的風味、提高營養(yǎng)進行了探討，以期為減少該地區(qū)因長期食用自制酸菜而引發(fā)的食道癌和胃癌的發(fā)生和生產腌制食品中降低亞硝酸鹽含量的研究提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試水樣 延安寶塔區(qū)、榆林佳縣等地腌制酸菜的酸菜水；培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基[6]、LB培養(yǎng)基[7]；對氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺、2，6-二氯酚靛酚、Ag2SO4均為分析純。

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 PYX-DHS-40*50-BS，上海躍進醫(yī)療器械廠；紫外分光光度計 UVmini-1240，日本島津；立式壓力蒸汽滅菌鍋 LS-B50L，江陰濱江醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞硝酸鹽降解菌的篩選

1.2.1.1 初篩 無菌操作將取得的酸菜水水樣在篩選培養(yǎng)基平板上劃線分離，挑取單菌落，多次重復，將純化得到的菌株于（4±1）℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 復篩 將初篩得到的菌株利用格里斯試劑比色法[8]檢測菌株對亞硝酸鹽的降解情況，選擇降解率較高的菌株作為下一步的實驗菌株。

1.2.2 實驗菌株降解亞硝酸鹽能力的檢測

1.2.2.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制 參照文獻[6]。

1.2.2.2 培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量的測定 取20mg/mL NaNO2溶液1mL加入到100mL篩選培養(yǎng)基中（培養(yǎng)液中NaNO2濃度為200mg/L），各實驗組加入復篩得到的菌株培養(yǎng)液5%，另取一組不加菌液作為空白對照，（35±1）℃靜置培養(yǎng)7d，每隔24h各取適量培養(yǎng)液，8000r/min離心15min，取一定量上清，按白雪娟等[8]的方法，測定各樣品的OD550，根據(jù)1.2.2.1繪制的NaNO2標準曲線可計算出各組樣品中NaNO2的殘留量。

1.2.2.3 亞硝酸鹽降解率的測定 根據(jù)以下公式可計算出不同實驗菌株對NaNO2的降解率：

式中：X0—不同培養(yǎng)時刻空白組樣品中NaNO2含量；X1—不同培養(yǎng)時刻實驗組樣品中NaNO2殘留量。

根據(jù)各實驗菌株不同培養(yǎng)時刻的降解率，選出降解率最高的一株為本研究的目的菌株，同時，繪制目的菌株對亞硝酸鹽的降解曲線。

1.2.3 亞硝酸鹽去向的研究 培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽減少后，可能被實驗菌株吸收利用，也可能被氧化為硝酸鹽，為了得知亞硝酸鹽的去向，在培養(yǎng)不同時刻測定亞硝酸鹽的同時，還需測定培養(yǎng)液中硝酸鹽的含量。

取1.2.2.2中第一步得到的濾液10mL，采用鋅粒還原法[9]測定培養(yǎng)液中硝酸鹽含量，根據(jù)NaNO2標準曲線計算濾液中還原后NaNO2總的含量，根據(jù)以下公式計算濾液中NaNO3含量：

X=（XB-XA）×1.232

式中：XA—不同培養(yǎng)時刻樣品中NaNO2含量；XB—不同培養(yǎng)時刻樣品中經(jīng)還原后NaNO2總含量；X—試樣中NaNO3含量。

以時間為橫坐標，以NaNO3含量為縱坐標，繪制培養(yǎng)液中NaNO3含量變化曲線。

1.2.4 實驗菌株降解亞硝酸鹽產生維生素C的研究 實驗菌株不僅要降低酸菜水中亞硝酸鹽的含量，還要能增加酸菜的營養(yǎng)，主要研究了酸菜水中維生素C的變化情況，維生素C含量測定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[10]，以時間為橫坐標、以維生素C含量為縱坐標，繪制不同培養(yǎng)時刻維生素C的含量曲線。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽降解菌的篩選結果

將取得的酸菜水水樣在篩選培養(yǎng)基固體平板上多次劃線分離后，得到22株菌，利用格里斯試劑比色法[8]初步篩選出具有降解亞硝酸鹽能力的實驗菌株11株，分別編號為SQ-1、SQ-2、SQ-3、SQ-4、SQ-5、SQ-6、SQ-7、SQ-8、SQ-9、SQ-10、SQ-11。

2.2 實驗菌株降解亞硝酸鹽能力的測定結果

2.2.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制 采用1.2.2.1的方法，繪制出的亞硝酸鈉標準曲線如圖1。

圖1 NaNO2標準曲線Fig.1 Standard curve of NaNO2

由繪制所得的標準曲線方程為y=0.4772x+0.0052，相關系數(shù)R2=0.9984，擬合度較好，可以用于后續(xù)實驗中的樣品測定。

2.2.2 實驗菌株降解亞硝酸鹽能力的測定結果 根據(jù)1.2.2.2和1.2.2.3的測定方法，各實驗菌株培養(yǎng)7d時對NaNO2的降解情況如圖2。

由圖2可知，11株實驗菌株除SQ-7外，其他菌株都對NaNO2有較高的降解率，其中SQ-4、SQ-5、SQ-9、SQ-10降解率都達到了80%以上，SQ-4降解率最高，達到了97.6%，因此，選擇SQ-4作為此次研究的目的菌株，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以OD550為縱坐標，繪制出菌株SQ-4在不同培養(yǎng)時刻對NaNO2降解曲線如圖3。

圖2 各實驗菌株對NaNO2的降解率Fig.2 The degradation rates of strains to NaNO2

圖3 菌株SQ-4對NaNO2的降解曲線Fig.3 Degradation curve of SQ-4 to NaNO2

由圖3可知，在開始0～5d，培養(yǎng)液中NaNO2含量急劇降低，第5d后趨于平緩，并且在第7d NaNO2幾乎全部消失，其降解率可達97.60%；而未加菌的對照組NaNO2含量略有下降，這可能是由于空氣中的氧將部分NaNO2氧化所致。

2.3 亞硝酸鹽去向的研究結果

培養(yǎng)液中的NaNO2含量明顯降低，可能被實驗菌株吸收利用，也可能被氧化為硝酸鹽，經(jīng)過測定，不同培養(yǎng)時刻培養(yǎng)液中NaNO2和NaNO3含量變化情況如圖4。

圖4 NaNO2和NaNO3含量變化曲線Fig.4 The content change of NaNO2and NaNO3

由圖4可知，在培養(yǎng)過程中，NaNO2含量明顯下降，而NaNO3卻沒有明顯變化，由此可知，減少的NaNO2并沒有被轉化為NaNO3，可能轉化為其他物質或是被SQ-4在生長過程中利用轉化為自身的物質。

2.4 菌株SQ-4產維生素C的研究

采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定不同培養(yǎng)時刻培養(yǎng)液中的VC的含量，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以VC的含量為縱坐標，得到VC含量變化情況如圖5。

圖5 SQ-4產VC曲線Fig.5 The content curve of VCproduced by SQ-4

由圖5可知，菌株SQ-4在利用NaNO2的過程中，能夠產生VC，并且其含量隨培養(yǎng)時間的延長而增加，這有助于增加酸菜的營養(yǎng)，改善酸菜的風味。

3 結論

3.1 本實驗經(jīng)過篩選得到11株對亞硝酸鹽具有降解能力的菌株，通過測定得知，菌株SQ-4在培養(yǎng)0～5d時，亞硝酸鹽迅速下降，7d時亞硝酸鹽含量降至最低，降解率高達97.60%。

3.2 通過還原法測定培養(yǎng)液中硝酸鹽含量，可知實驗菌株在降低亞硝酸鹽的過程中，并沒有將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，而是將亞硝酸鹽吸收利用轉化為菌體自身的物質或者轉化為其他物質。

3.3 實驗菌株在利用亞硝酸鹽的過程中，可以產生維生素C，而且維生素C的含量隨培養(yǎng)時間的延長而增加，由此可知，菌株SQ-4不僅可以降低酸菜水中的亞硝酸鹽，而且還可以實現(xiàn)改善酸菜風味，增加營養(yǎng)的功效。

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[10]王秀奇.基礎生物化學實驗[M].北京：高等教育出版社，2005：195-199.

Study on isolation of one bacterial strain capable of nitrite degeneration from traditional pickled vegetable and its characteristics

GAO Xiao-peng，SU Qing，CHENG Tong-pei
（College of Life Science，Yan’an University，Yan’an 716000，China）

Eleven strains which could degradate nitrite were isolated from sour pickled cabbage water from northern region of Shaanxi.The degradation rate of strian SQ-4 was 97.60%，after detection，result showed the nitrite couldn’t be oxidated to nitrate by strian SQ-4 and produced Vitamin C in the process.

nitrite；degradation；stains；Vitamin C

TS201.1

A

1002-0306（2012）01-0198-03

2011－01－14

高小朋（1976-），男，講師，研究方向：資源與環(huán)境微生物學。