內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎中虹膜固有組織細(xì)胞上MyD88與TLR-4的共表達(dá)△

許邦麗 王 婧 齊 欣 楊 碩 盧 弘

急性前葡萄膜炎的發(fā)生主要與革蘭陰性細(xì)菌感染有關(guān)，革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是固有免疫反應(yīng)的主要啟動因子。Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁LPS的模式識別受體，在機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中起重要作用。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis，EIU)中虹膜固有層組織巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)在炎癥過程中TLR-4的高表達(dá)[1]，提示TLR-4可能在急性前葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用[2]，由此我們推測TLR-4與LPS配體結(jié)合啟動了炎癥過程。本研究利用髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)通過LPS刺激 C3H/HeN(野生型)小鼠和C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠，檢測TLR-4及MyD88在EIU巨噬細(xì)胞上的表達(dá)，探討TLR-4、MyD88依賴信號途徑在急性前葡萄膜炎發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性C3H/HeN小鼠25只，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物有限公司。雄性C3H/HeJ小鼠5只，6～8周齡，購于南京大學(xué)模式動物研究所。C3H/HeN組分為LPS注射后 0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 不同時間點，每個時間點5只。

1.1.2 主要試劑與儀器 霍亂弧菌內(nèi)毒素 LPS(18001株，古典生物型，小川血清型，蘭州生物制品研究所)，TLR-4抗體、MyD88抗體、CD163抗體(美國Santa Cruz公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記驢抗大鼠二抗、TRITC標(biāo)記驢抗山羊二抗、Dylight649標(biāo)記的驢抗兔二抗(美國Jackson公司)。眼前節(jié)照相系統(tǒng)(Topcon眼前節(jié)照相系統(tǒng))，立體視顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制作與臨床觀察 將霍亂弧菌內(nèi)毒素LPS溶于無菌生理鹽水中，配成濃度為2 g·L－1的注射液，每只小鼠腹腔注射0.1 mL，注射后每隔2 h用裂隙燈觀察小鼠眼前節(jié)，必要時復(fù)方托品酰胺散瞳檢查，詳細(xì)記錄臨床體征并拍照。

1.2.2 動物灌注及標(biāo)本制備 進行小鼠心臟灌注，以消除血液對免疫組織化學(xué)結(jié)果的影響。小鼠腹腔注射 175 g·L－1水合氯醛(2 mL·kg－1)深麻醉，麻醉完全后仰臥固定于軟木板上，用體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒，腹部正中切口，至劍突后改為2條旁矢狀切口，暴露胸腔，左心室內(nèi)插管，插管成功后打開PBS閥門，立即在右心房做一1～2 mm切口使血液和灌注液流出，用肝素化的PBS(pH值7.4，每毫升PBS含1 U肝素)100～150 mL灌注，直至流出液體變?yōu)闊o色時，改為40 g·L－1多聚甲醛50 mL進行固定，可見小鼠肢體僵硬，四肢和尾巴肌肉痙攣，腸系膜血管透明、肝臟蒼白。摘除眼球放入40 g·L－1多聚甲醛中繼續(xù)固定1～2 h后，立體視顯微鏡下，在盛有PBS的培養(yǎng)皿中，將小鼠虹膜、睫狀體分離，放入裝有PBS的Eppendorf管中，置于－80℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 虹膜、睫狀體鋪片免疫熒光三標(biāo)記 為了觀察整個細(xì)胞的形態(tài)，增加組織樣本量，采用虹膜、睫狀體鋪片的方法，用免疫熒光三標(biāo)記檢測CD163、TLR-4、MyD88的共表達(dá)。20 mmol·L－1EDTA 四鈉抗原修復(fù)，37℃，3 min，將標(biāo)本放入24孔培養(yǎng)板，PBS洗5 min×3次;3 g·L－1Triton X-100室溫30 min;PBS洗5 min×3次;含體積分?jǐn)?shù)3%BSA和體積分?jǐn)?shù)10%驢血清的PBS孵育抗原封閉，室溫1 h，PBS洗5 min×3次;1∶50山羊抗小鼠CD163、1∶50大鼠抗小鼠TLR-4、1∶50兔抗小鼠MyD88一抗同時孵育(用 0.2 g·L－1Triton X-100 稀釋)，每孔 200 μL，4℃過夜;第 2天室溫平衡 30 min;PBS洗5 min×3次;在避光條件下，1∶50 TRITC標(biāo)記驢抗山羊二抗孵育，每孔 200 μL，室溫 2 h;PBS洗10 min×3次;1∶50 FITC標(biāo)記驢抗大鼠二抗孵育，每孔200 μL，室溫2 h，PBS洗 10 min ×3 次;1∶100 Dylight649標(biāo)記的驢抗兔二抗孵育，每孔200 μL，室溫2 h，PBS洗10 min×3次;抗熒光衰減封片劑封片。分別以PBS或親和純化正常驢IgG代替一抗作為陰性對照，陰性對照抗體濃度與一抗?jié)舛认嗤?，孵育條件相同，熒光顯微鏡觀察并拍照，相同視野的一對影像重疊后用影像處理軟件(Adobe Photoshop CS3)進行共表達(dá)分析。部分鋪片用激光共聚焦顯微鏡檢查。虹膜鋪片每象限取位于虹膜中部的一個高倍鏡視野進行計數(shù)，同一視野不同焦點平面進行疊加后總的陽性細(xì)胞數(shù)為該視野的細(xì)胞數(shù)。4個視野的平均值作為該眼球虹膜的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對多個樣本虹膜內(nèi)CD163陽性細(xì)胞數(shù)、TLR-4陽性細(xì)胞數(shù)以及MyD88陽性細(xì)胞數(shù)分別采用單因素方差分析進行檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EIU模型臨床表現(xiàn) C3H/HeN小鼠霍亂弧菌內(nèi)毒素LPS注射后12 h結(jié)膜囊內(nèi)出現(xiàn)白色分泌物，瞳孔區(qū)偶見白色滲出，晶狀體前表面可見色素性顆粒，24～48 h時前房內(nèi)炎癥達(dá)到高峰，散瞳后可見部分虹膜后粘連，72 h炎癥逐漸消退(圖1A)。C3H/HeJ小鼠霍亂弧菌內(nèi)毒素LPS注射后在整個觀察過程中沒有發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)(圖1B)。

2.2 虹膜、睫狀體鋪片免疫熒光三標(biāo)記 CD163、TLR-4和MyD88的表達(dá) 在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的C3H/HeJ小鼠虹膜中未檢測到CD163、TLR-4和 MyD88陽性細(xì)胞。而C3H/H3N小鼠注射LPS后，在虹膜和睫狀體中可見CD163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞表達(dá)，陽性細(xì)胞呈綠色熒光，定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，大部分細(xì)胞為類圓形。TLR-4陽性細(xì)胞呈紅色熒光，MyD88陽性細(xì)胞呈藍(lán)色熒光，IgG陰性對照中未見陽性細(xì)胞的表達(dá)(圖2)。C3H/HeN小鼠腹腔注射LPS后在虹膜鋪片內(nèi)0 h未見TLR-4、MyD88與CD163陽性表達(dá)，12 h后可見陽性細(xì)胞，24 h陽性細(xì)胞數(shù)較12 h明顯增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05);48 h陽性細(xì)胞數(shù)與24 h相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05);72 h陽性細(xì)胞數(shù)較48 h減少，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.01，見表1)。

Figure 1 Clinical manifestations of EIU.A:C3H/HeN mice at 24 hours after LPS injection，part of posterior synechia was seen after mydriasis;B:C3H/HeJ mice after LPS injection，no anterior chamber inflammation was seen EIU模型臨床表現(xiàn)。A:C3H/HeN小鼠注射LPS后24 h，散瞳后部分虹膜后粘連;B:C3H/HeJ小鼠注射LPS后，前房無炎癥表現(xiàn)

Figure 2 Images of immunofluorescence and laser confocal microscope scanning at 24 hours.A:Immunofluorescence displayed CD163 labeled macrophages;B:Immunofluorescence displayed TLR-4;C:Immunofluorescence displayed MyD88;D:Laser confocal microscope scanning clearly showed the co-expression of TLR-4 and MyD88 on macrophages marked by CD163 24 h虹膜免疫熒光與激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果。A:免疫熒光顯示CD163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞;B:免疫熒光顯示TLR-4;C:免疫熒光顯示MyD88;D:激光共聚焦顯微鏡掃描顯示TLR-4和MyD88在CD163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞上共表達(dá)

表1 C3H/HeN小鼠注射LPS后不同時間點CD163、TLR-4、MyD88 陽性細(xì)胞數(shù)Table 1 CD163+，TLR-4+and MyD88+cells in C3H/HeN mice at different time points after LPS injection

3 討論

葡萄膜炎是常見的致盲眼病，前葡萄膜炎是葡萄膜炎中最常見的一種類型[3]，由于其病因、發(fā)病機制還不十分明確，因此尚無理想有效的治療方法。雖然免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素有一定的療效，但仍不能阻止葡萄膜炎的復(fù)發(fā)，最終致使視功能下降或視力喪失。所以，深入研究急性前葡萄膜炎的發(fā)病機制，尋找新的免疫療法是葡萄膜炎研究領(lǐng)域中的重要課題之一。

有文獻(xiàn)報道，急性前葡萄膜炎的發(fā)生主要與革蘭陰性細(xì)菌感染有關(guān)[4]。盧弘[5]用霍亂弧菌內(nèi)毒素在Wistar大鼠成功地誘導(dǎo)出臨床可見的葡萄膜炎。Chang等[6]在正常人虹膜、睫狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有 TLR-4陽性的樹突狀細(xì)胞。Chen等[1]發(fā)現(xiàn)在大鼠EIU中TLR-4表達(dá)增高。

組織固有的巨噬細(xì)胞是機體內(nèi)最早吞噬外來抗原并對感染做出反應(yīng)的細(xì)胞之一。CD163是體內(nèi)血紅蛋白的特異清道夫受體，也是組織固有巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記蛋白。近年來CD163被認(rèn)為是選擇性活化的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的一類模式識別受體，且在免疫抑制中起作用[7]，能識別細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁多糖和脂質(zhì)，介導(dǎo)吞噬作用。它們以化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)、多核苷酸、多糖和磷脂等作為配體并可促進其胞吞作用，起著清除體內(nèi)有毒物質(zhì)及衰老、凋亡或壞死細(xì)胞的作用。CD163作為一種跨膜蛋白存在于活化的巨噬細(xì)胞膜表面，當(dāng)機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，巨噬細(xì)胞大量活化，高表達(dá)CD163，本研究發(fā)現(xiàn)虹膜、睫狀體均可見類圓形巨噬細(xì)胞，血管周圍多見，且在CD163高表達(dá)的同時TLR-4表達(dá)也增高。TLR-4基因敲除的小鼠不能誘導(dǎo)出葡萄膜炎。同樣本研究在小鼠EIU模型的虹膜鋪片中，用免疫熒光三標(biāo)記的方法進一步證實了在巨噬細(xì)胞上TLR-4和MyD88共表達(dá)，MyD88與TLR-4的表達(dá)曲線基本一致，TLR-4基因敲除的小鼠 TLR-4和MyD88均無表達(dá)，提示在TLR-4的介導(dǎo)下巨噬細(xì)胞參與了機體的固有免疫，可能通過MyD88依賴信號途徑導(dǎo)致后續(xù)炎癥的級聯(lián)擴大。

目前發(fā)現(xiàn)TLR信號通路有兩條:一條為MyD88依賴信號途徑，一條為 MyD88非依賴信號途徑。MyD88依賴信號途徑是所有TLR(TLR-3除外)共有的，MyD88為TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要接頭蛋白，它的C端含TLR結(jié)構(gòu)域與TLR胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，N端通過死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)募集下游含有DD結(jié)構(gòu)域的信號分子使信號下傳，可激活核因子-κB和激活蛋白-1，進而促進核因子-κB控制的基因表達(dá)，參與炎癥介質(zhì)(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α 等)、黏附分子以及NO合酶等的轉(zhuǎn)錄，促進表達(dá)共刺激因子CD40、CD80、CD86，并且通過反饋環(huán)路導(dǎo)致炎癥過程的放大和持續(xù)[8-11]。Li等[12]在大鼠的 EIU模型中發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88、核因子-κB表達(dá)上調(diào)。這說明急性前葡萄膜炎的發(fā)病過程中，MyD88在LPS活化通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，TLR-4對其下游信號分子的激活是通過MyD88依賴信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的。Xu等[13]在小鼠EIU模型中，發(fā)現(xiàn)房水中炎癥介質(zhì)(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α 等)升高。由此，TLR-4可能在急性前葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[14]。

TLR的發(fā)現(xiàn)是免疫學(xué)的一項重大進展，TLR-4是一類重要模式識別受體，能識別外源性和內(nèi)源性配體，TLR能有效識別“非己”成分而被活化，然后通過上調(diào)與吞噬有關(guān)的基因表達(dá)，增強巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的吞噬能力及殺傷能力，不僅在天然免疫中發(fā)揮重要作用，還是連接天然免疫與特異性免疫的主要橋梁。本研究發(fā)現(xiàn)在C3H/HeN小鼠的EIU模型中，CD163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞中TLR-4、MyD88共表達(dá)，進一步揭示虹膜固有層巨噬細(xì)胞參與了機體的固有免疫，LPS激活了細(xì)胞膜表面的TLR-4，并且通過MyD88依賴信號途徑向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究還只是處于初步階段，我們期望通過對轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的上游關(guān)鍵分子的阻斷為治療急性前葡萄膜炎提供新的思路。

1 Chen W，Hu X，Zhao L，Li S，Lu H.Expression of toll-like receptor 4 in uvea-resident tissue macrophages during endotoxin-induced uveitis[J].Mol Vis，2009，15(6):619-628.

2 盧 弘，陳 巍，趙 麗.Toll樣受體-4在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎中的表達(dá)及意義[J].眼科，2008，17(1):48-51.

3 Rathinam SR，Namperumalsamy P.Global variation and pattern changes in epidemiology of uveitis[J].Indian J Ophthalmol，2007，55(2):173-183.

4 Wakefield D，Montanaro A，McCluskey P.Acute anterior uveitis and HLA-B27[J].Surv Ophthalmol，1991，36(3):223-232.

5 盧 弘.霍亂弧菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠葡萄膜炎的組織切片研究[J].眼科新進展，2002，22(6):384-386.

6 Chang JH，McCluskey P，Wakefield D.Expression of toll-like receptor 4 and its associated lipopolysaccharide receptor complex by resident antigen-presenting cells in the human uvea[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(6):1871-1878.

7 Polfliet MM，F(xiàn)abriek BO，Daniels WP，Dijkstra CD，van den Berg TK.The rat macrophage scavenger receptor CD163:expression，regulation and role in inflammatory mediator production[J].Immunobiology，2006，211(6-8):419-425.

8 Sandor F，Buc M.Toll-like receptors.I.structure，function and their ligands[J].Folia Biologica(Praha)，2005，51(5):148-156.

9 Janssens S，Beyaert R.Role of Toll-like receptors in pathogen recognition[J].Clin Microbiol Rev，2003，16(4):637-646.

10 Gioannini TL，Teghanemt A，Zhang D，Coussens NP，Dockstader W，Ramaswamy S，et al.Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(12):4186-4191.

11 Lu YC，Yeh WC，Ohashi PS.LPS/TLR4 signal transduction pathway[J].Cytokine，2008，42(2):145-151.

12 Li S，Lu H，Hu X，Chen W，Xu Y，Wang J.Expression of TLR4-MyD88 and NF-κB in the iris during endotoxin-induced uveitis[J].Mediators Inflamm，2010，2010:748218.Epub 2010 Aug 3.

13 Xu Y，Chen W，Lu H，Hu X，Li S，Zhao L.The expression of cytokines in the aqueous humor and serum during endotoxin-induced uveitis in C3N/HeN mice[J].Mol Vis，2010，16(12):1689-1695.

14 Chi ZL，Hayasaka S，Zhang XY，Hayasaka Y，Cui HS.Effects of rolipram，a selective inhibitor of type 4 phosphodiesterase，on lipopolysaccharide-induced uveitis in rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(8):2497-2502.