抗吡蟲(chóng)啉、高效氯氰菊酯棉蚜品系的室內(nèi)篩選及適合度研究

孫磊，楊德松

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子832003）

棉蚜（Aphis gossypii Glover）屬同翅目蚜科蚜屬，其年發(fā)生代數(shù)多，繁殖力強(qiáng)，是棉花的重要害蟲(chóng)之一［1］。1991、1994和2004年，棉蚜在新疆北疆各地暴發(fā)，損失率達(dá)10%～30%［2－3］。由于棉蚜世代歷期短、發(fā)生量大，并且長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，加之未能科學(xué)用藥，從而導(dǎo)致棉蚜抗藥性的快速發(fā)展，其抗性程度高，抗性背景復(fù)雜，這給棉花生產(chǎn)造成了很大的困難［4］。雖然新疆棉花采用了膜下滴灌的栽培方式，但并未影響棉蚜的發(fā)生［5］，因而化學(xué)防治依然是防治棉蚜的首選措施。關(guān)于蚜蟲(chóng)抗性品種室內(nèi)選育的報(bào)道較多，帥霞等［6］用高效氯氰菊酯對(duì)桃蚜進(jìn)行抗性選育，篩選3代后相對(duì)抗性倍數(shù)為13.00，10代后為49.86倍。陳亮［7］用吡蟲(chóng)啉對(duì)桃蚜敏感品系在室內(nèi)進(jìn)行了抗性選育，測(cè)定了桃蚜抗吡蟲(chóng)啉品系對(duì)9種常用殺蟲(chóng)劑的交互抗性。楊煥青等［8］在室內(nèi)用吡蟲(chóng)啉對(duì)敏感種群棉蚜連續(xù)汰選27代，對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性達(dá)24.38倍。殺蟲(chóng)劑長(zhǎng)期使用勢(shì)必產(chǎn)生抗藥性，吡蟲(chóng)啉屬于新型煙堿類殺蟲(chóng)劑，在新疆棉區(qū)是防治棉蚜首選藥劑。

為延長(zhǎng)現(xiàn)有農(nóng)藥在新疆棉區(qū)的使用壽命，有效控制棉蚜，闡明新疆棉區(qū)棉蚜種群對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性現(xiàn)狀，揭示棉蚜的抗藥性機(jī)理，本研究利用生命表研究棉蚜的抗性種群穩(wěn)定性，旨在為合理制定棉蚜的抗性治理措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試蟲(chóng)源

棉蚜敏感品系（S）由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲(chóng)教研室提供，該種群是室內(nèi)經(jīng)連續(xù)2年的無(wú)毒飼養(yǎng)，期間未曾接觸任何化學(xué)農(nóng)藥，選取整齊一致的無(wú)翅成蚜為標(biāo)準(zhǔn)試蟲(chóng)。棉蚜抗吡蟲(chóng)啉品系（Im R）與棉蚜抗高效氯氰菊酯系（BeR）是由敏感品系在室內(nèi)經(jīng)藥劑處理12代。輪換使用吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯對(duì)敏感品系篩選11代獲得交互抗性品系（ImBeR）。上述試蟲(chóng)均是在溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度60%±10%、光周期14 L∶10 D的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2供試藥劑

95.5 %吡蟲(chóng)啉（WP）、95%高效氯氰菊酯（WP）由南京卓創(chuàng)化學(xué)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1生物測(cè)定方法

測(cè)定方法采用葉片浸漬法［9］。將有蚜蟲(chóng)的棉花葉片分別浸入不同濃度藥液10 s，取出后讓葉片表面水滴自然揮發(fā)，反面朝上放置在培養(yǎng)皿中，24 h后檢查死蚜數(shù)，檢查時(shí)用毛筆撥動(dòng)蟲(chóng)體，試蟲(chóng)完全不動(dòng)視為死亡。若對(duì)照死亡率＞20%，則當(dāng)天全部處理作廢，若對(duì)照死亡率＜20%為有效測(cè)定。每種藥劑設(shè)置5個(gè)濃度，以丙酮為對(duì)照，每濃度處理20頭，3個(gè)重復(fù)。根據(jù)死亡機(jī)率值和濃度對(duì)數(shù)值求出毒力回歸式（Y＝A＋BX）、致死中量LD50及診斷量LD99值，并與敏感棉蚜種群進(jìn)行毒力比較，計(jì)算棉蚜的敏感性或抗藥性水平［10］。

1.2.2抗性選育數(shù)據(jù)處理

利用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求出敏感種群與抗性種群的毒力回歸方程，求出LD50，95%置信限?？剐员稊?shù)等于棉蚜抗性種群LD50與敏感種群LD50的比值抗性指數(shù)，計(jì)算公式為：

1.2.3抗性適合度研究

1.2.3.1 試驗(yàn)種群生命表的組建

在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)用瓊脂培養(yǎng)基保濕，將新鮮葉片背面向上鋪在培養(yǎng)基上。四周用脫脂棉棉條纏繞，用來(lái)保濕并防止棉蚜逃逸。每一葉片接同一天若蚜1頭，4－5 d更換1次新鮮棉花葉片，逐日觀察記錄蛻皮、死亡率，待產(chǎn)蚜后記錄日產(chǎn)蚜量，并剔除當(dāng)日產(chǎn)下蚜蟲(chóng)，直到棉蚜全部死亡。

1.2.3.2 數(shù)據(jù)處理

參照丁巖欽［11］的方法，組建棉蚜的實(shí)驗(yàn)種群生命表，計(jì)算生命表各項(xiàng)參數(shù)。用DPS和Excell軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

其中：R0為種群凈增殖率，rm為種群內(nèi)稟增長(zhǎng)力，T為世代周期，λ為周限增長(zhǎng)率，Dt為種群加倍時(shí)間。

1.2.4解毒酶活性測(cè)定

酶源蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照Bradford［12］的考馬斯亮藍(lán)G－250染色法；羧酸酯酶（Car E）活性測(cè)定參照Han等［13］的方法；酸性、堿性磷酸酯酶（ACP、ALP）活性測(cè)定參照高希武等［14］的方法；谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性測(cè)定參照 Oppenoorth［15］的方法。

1.2.5多功能氧化酶（MFO）活性測(cè)定

以對(duì)硝基苯酚量為自變量，OD值為因變量作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用對(duì)硝基苯甲醚（丙酮為溶劑，0.05 mol／L）作底物，在氧和NADPH作電子供體條件下，MFO催化發(fā)生氧脫甲基作用生成對(duì)硝基苯酚。用鹽酸（1 mol／L）終止反應(yīng)后，先后用氯仿、NaOH溶液（0.5 mol／L）萃取，在400 nm處測(cè) OD值。根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶源蛋白質(zhì)含量，將OD值換算成比活力［nmol／mg·Pro.／30min）］，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯的抗性及交互抗性

由于吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯的作用機(jī)理不同，在抗性選育過(guò)程中棉蚜對(duì)這兩種藥劑的抗性發(fā)展速度也表現(xiàn)出一定的差異性，吡蟲(chóng)啉汰選敏感棉蚜12代篩選出抗性倍數(shù)為7.90的抗性品系，而高效氯氰菊酯汰選12代后獲得抗性倍數(shù)為10.04的抗性品系（表1）。

表1 吡蟲(chóng)啉對(duì)棉蚜抗性篩選動(dòng)態(tài)（2011年，石河子）Tab.1 Resistance development of A.gossypii to Imidacloprid（2011，Shihezi）

表2 棉蚜對(duì)高效氯氰菊酯的抗性篩選動(dòng)態(tài)（2011年，石河子）Tab.2 Resistance development of A.gossypii to Beta－cypermethrin（2011，Shihezi）

表3 棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯的交互抗性篩選動(dòng)態(tài)（2011年，石河子）Tab.3 Cross resistance development of A.gossypii to Imidacloprid and Beta－cypermethrin（2011，Shihezi）

2.2 敏感品系與抗性品系棉蚜的適合度

不同品系棉蚜的存活率下降趨勢(shì)基本一致，敏感品系的存活率均高于其他3個(gè)抗性品系，表明棉蚜產(chǎn)生抗性以后，其存活率弱于敏感品系（圖1）。3種棉蚜品系均能完成其世代，棉蚜的敏感品系的產(chǎn)卵量高于具有抗性的品系表明產(chǎn)生抗性以后產(chǎn)若率有所下降（圖2～4）。

圖1 棉蚜敏感與抗性品系存活率動(dòng)態(tài)Fig.1 Survival rate between sensitive and resistant strains of A.gossypii

圖2 棉蚜敏感品系與抗性品系產(chǎn)仔量日變化Fig.2 Diurnal variation of fertility between sensitive and resistant strains of A.gossypii

圖3 不同棉蚜種群世代產(chǎn)若量Fig.3 The amount of generation Nymphs producing by different populations of A.gossypii

圖4 棉蚜敏感品系和抗性品系日產(chǎn)若量Fig.4 The amount of diurnal Nymphs producing by different populations of A.gossypii

棉蚜抗性品系和敏感品系的發(fā)育速率、世代歷期和成蚜壽命等方面均無(wú)顯著差異（表4、5）。棉蚜敏感品系的生殖力弱于棉蚜的抗性品系（圖2）。根據(jù)棉蚜的若蚜存活率和凈生殖率等參數(shù)建立年齡特征生命表（表5）。棉蚜抗性品系平均日產(chǎn)仔量低于敏感品系，成蚜生殖期短于敏感品系，且日產(chǎn)若量低于敏感品系，結(jié)果表明抗性品系的生物適合度明顯降低。

表4 棉蚜敏感品系和抗性品系發(fā)育歷期比較Tab.4 The comparison of developmental duration between sensitive and resistant strains of A.gossypii

表5 棉蚜的抗性、敏感品系實(shí)驗(yàn)種群生命表Tab.5 Life－table of resistant and sensitive populations of A.gossypii

2.3 敏感品系與抗性品系棉蚜解毒酶活性比較

由表6可見(jiàn)，BeR品系棉蚜的羧酸酯酶比活力與敏感品系存在顯著差異，高于敏感品系。3個(gè)抗性品系棉蚜的酸性、堿性磷酸酯酶、MFO酶與敏感品系無(wú)差異性，但谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶與敏感棉蚜相比差異顯著，高于敏感棉蚜。說(shuō)明谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是解毒吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯的主要解毒酶，在解毒吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯中起重要作用。

表6 不同棉蚜種群解毒酶比活力Tab.6 Detoxifying enzymes of different populations of A.gossypii

3 討論

抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估除了觀察抗性的篩選速度外，還需對(duì)抗性害蟲(chóng)的適合度進(jìn)行測(cè)定。本研究對(duì)吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯進(jìn)行抗性篩選，用吡蟲(chóng)啉選育至12代抗性為7.90（表1），高效氯氰菊酯的抗性選育到12代為10.04（表2），用吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯同時(shí)選育至11代抗性分別為5.40和6.43（表3）。研究表明，吡蟲(chóng)啉相對(duì)于高效氯氰菊酯的抗性發(fā)展速度緩慢，說(shuō)明新疆棉花生產(chǎn)中應(yīng)用吡蟲(chóng)啉防治棉蚜比高效氯氰菊酯相對(duì)安全，但是長(zhǎng)期繼續(xù)使用，可能會(huì)產(chǎn)生抗藥性。

生物適合度是指一個(gè)生物能生存，并且把它的生物學(xué)特性傳給下一代的相對(duì)能力，一般包括繁殖力和生活力等?？顾幮酝黾恿撕οx(chóng)抗性個(gè)體，在藥劑選擇壓力下的存活率，然而抗藥性往往導(dǎo)致生物適合度降低，使害蟲(chóng)抗性個(gè)體，在沒(méi)有藥劑選擇壓力時(shí)，表現(xiàn)出生存競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)［16］。楊煥青等［8］提出抗吡蟲(chóng)啉品系棉蚜，其產(chǎn)生的若蚜存活率、凈生殖率、內(nèi)稟增長(zhǎng)率和周限增長(zhǎng)率較敏感品系均有顯著降低，相對(duì)適合度較小。陳亮［7］研究得出抗吡蟲(chóng)啉桃蚜品系的凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率均低于敏感品系，存在適合度不利性。于金鳳等［17］研究發(fā)現(xiàn)抗滅多威和抗硫丹的棉蚜種群的繁殖力與敏感品系相比明顯降低。吳孔明等［18］發(fā)現(xiàn)抗殺滅菊酯高抗品系的若蚜發(fā)育歷期短于敏感若蚜。劉鳳沂等［19］研究報(bào)道昆蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生伴有適合度劣勢(shì)，即抗性個(gè)體常表現(xiàn)出發(fā)育速率較慢、存活率和生殖力較低。本研究也同樣證實(shí)3種抗性品系的棉蚜與敏感品系棉蚜相比較在凈生殖力、內(nèi)稟增長(zhǎng)率等存在適合度不利性。

羧酸酯酶、磷酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶和MFOs是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒酶系，潘文亮等［20］研究抗吡蟲(chóng)啉棉蚜品系中羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的比活力明顯高于敏感品系。帥霞等［6］發(fā)現(xiàn)高效氯氰菊酯篩選桃蚜的過(guò)程中，LD50與酯酶含量及活性變化之間呈顯著正相關(guān)，酯酶在桃蚜對(duì)高效氯氰菊酯抗藥性發(fā)展中起著十分重要的作用。呂敏等［21］研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，與昆蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。楊煥青［8］測(cè)定出抗吡蟲(chóng)啉棉蚜種群的羧酸酯酶和谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶比敏感品系高2.73和1.57倍，說(shuō)明羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶比活力的提高是引起棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。慕立義等［22］研究表明敏感品系棉蚜在氰戊菊酯、氧化樂(lè)果連續(xù)篩選16代后，對(duì)氰戊菊酯、氧化樂(lè)果產(chǎn)生了抗性及交互抗性，測(cè)得3個(gè)抗性種群的羧酸酯酶明顯高于敏感品系。本研究中發(fā)現(xiàn)棉蚜產(chǎn)生抗性與羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶有關(guān)。棉蚜ImR、BeR、ImBeR三種抗性品系的谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶與敏感棉蚜相比較顯著高于敏感棉蚜；BeR品系的羧酸酯酶顯著高于敏感棉蚜，說(shuō)明這些酶在解毒吡蟲(chóng)啉和高效氯氰菊酯的過(guò)程中起作用。因此，生產(chǎn)中建議吡蟲(chóng)啉與一些無(wú)交互抗性的藥劑進(jìn)行輪換使用可以阻止或延緩棉蚜抗藥性的產(chǎn)生。

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