四種檢測法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比較

胡洪華 蔣 婷 宋海星 胡瀚丹

1.成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，四川成都 610083；2.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川成都 610083

四種檢測法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比較

胡洪華1蔣 婷1宋海星2▲胡瀚丹1

1.成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，四川成都 610083；2.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川成都 610083

目的比較四種方法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的檢測效果，建立一種能快速檢測去蛋白率的方法。 方法用乙腈沉淀法去除血清蛋白，分別應用四種不同的檢測分析方法，方法Ⅰ通過真空凍干；方法Ⅱ通過真空干燥；方法Ⅲ通過設立對照調零；方法Ⅳ通過揮干乙腈，分析血清蛋白的去除率。 結果 方法Ⅰ和方法Ⅱ耗時長、設備要求高；方法Ⅲ耗時最短、方法簡便；方法Ⅳ耗時較短、但容易產生實驗誤差，方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白去除率結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與方法Ⅳ比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 方法Ⅲ為最佳的分析測定分析方法，可用于快速方便了解乙腈的去蛋白率。

乙腈沉淀法；血清蛋白；去蛋白率

研究表明血清中有20多種高豐度蛋白質，占血清總蛋白的80%以上，而對疾病診斷有密切關系的蛋白含量甚微[1]。在檢測過程中血清高豐度蛋白質不僅會掩蓋許多重要低豐度蛋白質，還會相對減小低豐度蛋白質的上樣量，使得低豐度蛋白質的難分離純化[2]。在進行蛋白組研究中，對血清樣本進行預處理，去除血清中的高分子量、高豐度蛋白質，排除它們對低豐度蛋白質的掩蓋作用，促進低豐度蛋白質的檢出很有必要。目前常用的去蛋白技術有蛋白質沉淀法、親和技術、色譜技術等[3]。蛋白質沉淀法是一種快速蛋白質去除方法，乙腈沉淀法能去除血清中高豐度蛋白,是一種簡便、經濟、有效的前期處理方法[4]?？焖贆z測出乙腈的去蛋白率在研究中顯得十分必要，本研究旨在探索一種新的快速的檢測方法檢測其去蛋白率。

1 材料與方法

1.1 材料

血清標本來源于GIBCO公司生產的小牛血清；乙腈（ACN）為美國sigma公司生產；吸光度檢測儀為ND-1000分光光度計；Block Heaters GL-50為海門市其林貝爾儀器有限公司生產；高速冷凍離心機為Eppendorf公司產品；真空冷凍凍干系統(tǒng)為美國Themo公司產品。

1.2 方法

從-80℃取出血清于4℃條件下解凍，解凍后，用超純水稀釋成5倍和25倍共3個待測血清樣本。每個樣品進行4次平行試驗，每個待測濃度按四種分析方法進行分析檢測，分別計算每種分析方法的去蛋白率。見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間分析比較采用配對樣本t檢驗，去蛋白率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察結果

去除蛋白后的上清液較去除蛋白前比較顏色明顯變淡，干燥后的樣本有黃色固體物附著于管壁，用超純水溶解于1.5 mL的EP管中，溶液澄清透明，如水樣。其顏色深淺與蛋白濃度成正相關。

2.2 四種方法提取成功結果及耗時比較分析

四種方法對三種不同濃度的樣本進行去蛋白的處理，每個樣本進行四次獨立實驗，分別檢測其去蛋白率。分析四種方法的實驗成功率和耗時，四種方法的成功率均為100%，四種方法的耗時差異明顯，方法Ⅲ通過建立實驗對照組，通過調零，方便、快捷、耗時短（表 2）。

表1 檢測方法

表2 四種方法提取的實驗結果

2.3 紫外分光光度法檢測蛋白濃度

四種方法對三種不同濃度的樣本進行去蛋白處理，通過紫外分光光度法檢測樣品去蛋白前后的蛋白濃度，并通過4次復實驗分析去蛋白前后的蛋白濃度（表3）。

表3 紫外分光光度法檢測分析個樣本的蛋白濃度（±s，ng/μL）

表3 紫外分光光度法檢測分析個樣本的蛋白濃度（±s，ng/μL）

編號 樣品濃度 去蛋白前蛋白濃度 去蛋白后蛋白濃度方法Ⅰ方法Ⅱ方法Ⅲ方法Ⅳ高中低高中低高中低高中低45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 0.97±0.04 0.28±0.05 0.13±0.03 0.91±0.07 0.30±0.02 0.18±0.09 0.37±0.07 0.17±0.11 0.01±0.01 3.36±0.06 1.38±0.07 0.52±0.06

2.4 去蛋白率的分析

方法Ⅰ、Ⅱ和方法Ⅳ相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與方法Ⅲ比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5 標本蛋白濃度對去蛋白率影響的分析

標本蛋白濃度對去蛋白率的影響應用標本蛋白濃度的單因素方差分析表明，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？梢姌吮镜鞍诐舛纫蛩貙θサ鞍茁薀o影響。

3 討論

質譜鑒定蛋白技術已經比較成熟，樣品有一定的純度和濃度是得到比較準確的結果的前提條件，而高豐度蛋白的存在必然嚴重干擾小分子蛋白質的分離檢測和鑒定[5]。理想的蛋白質去除技術應該是具有選擇性的,即能100%地去除不需要研究的高豐度蛋白質，同時又對擬研究的小分子蛋白質的含量或活性不產生影響[6-7]。乙腈去蛋白質法是一種快速的去除雜質蛋白質的方法，在研究中即時知道乙腈的去蛋白效果是每位研究者急切關注的問題。

綜合以上四種檢測乙腈去除高豐度蛋白質的方法，可以看出方法Ⅰ是種參考方法，通過低溫凍干的方式將含低豐度蛋白質的溶液凍干，再用超純水復溶檢測計算乙腈的去蛋白率。方法Ⅱ是一種常用方法，但其耗時較長。方法Ⅳ通過揮干的方式去掉溶劑，在實驗過程中對設備的要求較高且容易產生實驗誤差。本研究提示方法Ⅳ與其他方法相比，蛋白檢測率差異明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過比較，結果提示在實驗中通過建立對照組，在紫外法檢測蛋白濃度時使用對照調零去除乙腈對的干擾，可快速檢測出乙腈的去蛋白效果。

[1]Steel LF，Trotter MG，Nakajma PB，et al.Efficient and specific removal of album in from human serum samples[J].Mol Cell Proteomics，2003，2（4）：262-270.

[2]Adkins JN，Varnum SM，Auberry KJ，et al.Toward a human blood serum proteome analysis by multid in ensional separation coupled with mass spectrometry[J].Mol Cell Proteomics，2002，1（12）：947-955.

[3]覃健，張志勇，何敏，等.兩種去除血清高豐度蛋白方法的比較[J].預防醫(yī)學情報雜志，2010，26（4）：322-324.

[4]覃健，胡天橋，張志勇，等.乙腈沉淀法去除人血清中高豐度蛋白的探索性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（5）：963-964.

[5]Diamandis EP.Mass spectrometry as a diagnostic and a can cerbiomarker discovery tool opportunities and potential limitations [J].Mol Cell Proteomics，2004，3（4）：367-378.

[6]Ramstrm M，Hagman C，Jennifer K，et al.Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transformion cyclotron resonance mass spectrometry[J].J Proteome Res，2005，4（2）：410-416.

[7]Zolotarjova N，Martosella J，Nicol G，et al.Differences among techniques forhigh-abundantproteindepletion[J].Proteomics，2005，5（13）：3304-3313.

Comparison of four method for removing serum protein by acetonitrile precipitation

HU Honghua1JIANG Ting1SONG Haixing2▲HU Handan1
1.School of Laboratory Medicine,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China;2.Department of Biomedical Sciences,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China

Objective To compare the test effect of serum protein removal rate by acetonitrile precipitation with four different methods,the aim is to establish a rapid test method to detect the serum protein removal rate.Methods The serum proteins were removed by acetonitrile precipitation experiments,and applied for four different detection methods,vacuum freeze-drying(methodⅠ),vacuum drying(methodⅡ),controlled through the establishment of zero(method Ⅲ),dryness acetonitrile(methodⅣ)were detected the serum protein removal rate in respect.Results MethodⅠand methodⅡwere time-consuming and higher equipment requirements,while methodⅢwas time-saving and simple,although methodⅣwas time-saving,it was prone to experimental error,methodⅠ,Ⅱ andⅢ proteins removal results revealed no significant difference (P>0.05)compared with methodⅣ,which had statistically significant difference (P<0.05).Conclusion MethodⅢis the best analysis of measurement and analysis method,and can be used to understand the removal quickly and easily.

Acetonitrile precipitation;Serum proteins;Protein removal rate

R446.1

A

1673-7210（2012）08（b）-0085-02

成都醫(yī)學院創(chuàng)新性實驗項目（CX2010013）?！?/p>

2012-03-28 本文編輯：谷俊英）