大鼠腦挫傷后堿性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)變化與損傷時間的推斷研究

賈美娟 梁新華 焦 炎

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001

大鼠腦挫傷后堿性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)變化與損傷時間的推斷研究

賈美娟 梁新華 焦 炎

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001

目的 研究大鼠腦挫傷后腦組織中堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）時序性表達(dá)的規(guī)律，探討bFGF的表達(dá)與腦損傷經(jīng)過時間的關(guān)系，旨在為法醫(yī)實(shí)踐中推斷早期腦損傷時間提供科學(xué)依據(jù)。 方法 參照Feeney′s法建立SD大鼠腦損傷模型，每組8只將實(shí)驗(yàn)動物（n=64）隨機(jī)分為8個組（7個實(shí)驗(yàn)組，1個對照組），其中實(shí)驗(yàn)組依據(jù)損傷時間的不同分為 1、6、12 h、1、2、3、7 d 共 7 個亞組。應(yīng)用免疫組化（SABC）法及免疫印跡（Western blot）法檢測大鼠腦組織bFGF的含量。 結(jié)果 腦挫傷后6 h陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，3 d達(dá)峰值，7 d已開始下降，但仍高于基礎(chǔ)水平。 結(jié)論挫傷后腦組織中bFGF的表達(dá)呈現(xiàn)出一定的時序性規(guī)律，為早期腦損傷時間的推斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

法醫(yī)學(xué)；bFGF；損傷時間；免疫印跡法；SABC

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）屬于成纖維細(xì)胞生長因子家族，是一種存在廣泛的多功能肽類生長因子，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、分化和細(xì)胞生長周期中發(fā)揮著重要的作用[1]。bFGF廣泛存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中，對神經(jīng)組織具有生長分化、維持存活的作用，是有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。本文采用自由落體裝置建立大鼠腦挫傷模型，聯(lián)合采用免疫組化（SABC）法及免疫印跡（Western blot）法兩種方法檢測該模型中腦挫傷后不同時間段大鼠腦組織中bFGF含量的變化，探討腦挫傷后bFGF表達(dá)的變化與時間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

從山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購入健康成年SD大鼠64只，體重為250 g左右，雌雄均可，隨機(jī)分為8組（7個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組），其中實(shí)驗(yàn)組依據(jù)損傷時間不同隨機(jī)命名為 1 h組、6 h組、12 h組、1 d組、2 d組、3 d組、7 d組。

1.2 腦挫傷模型的建立及取材

應(yīng)用自由落體打擊裝置建立腦挫傷模型（參照Feeney′s法[2]）。首先動物稱重后，腹腔注射4%戊巴比妥（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，后應(yīng)用大鼠腦立體定位儀將實(shí)驗(yàn)動物固定于手術(shù)臺，頭頂部去毛備皮，酒精消毒后，于頂部正中縱形切口，開直徑為4 mm的圓形骨窗（顱骨中線旁2 mm、人字縫前方3 mm處），手術(shù)成功完成后，選取40 g鐵質(zhì)砝碼模擬重錘從30 cm高處自由落體打擊手術(shù)中暴露的腦組織，肉眼見損傷處腦組織略微腫脹隆起，輕微出血。對照組動物行假手術(shù)處理，但不受打擊。對照組和腦損傷組大鼠術(shù)后均常規(guī)喂養(yǎng)。腦損傷組動物分別于傷后 1、6、12 h、1、2、3、7 d 剪頭并取出腦組織，于腦損傷部位取材，后在4%多聚甲醛PBS液中固定24 h，后行免疫組織化學(xué)染色；另取腦挫傷灶組織100 mg液氮中保存，備用于蛋白提取。對照組大鼠取材及組織處理同腦損傷組大鼠。

1.3 方法

1.3.1 SABC染色法 4%多聚甲醛PBS固定液中取出腦組織，常規(guī)包埋切片（厚度5 μm），具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。①3%H2O2孵育滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS液充分沖洗。②滴加山羊血清1～2滴，37℃下孵育20 min后傾去。③滴加經(jīng)稀釋為1∶100的一抗，過夜后PBS沖洗。④滴加二抗，37℃孵育3 min，PBS液沖洗2次。⑤滴加SABC工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗。⑥鏡下顯色，觀察結(jié)果。⑦蒸餾水淋洗終止顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后封片，觀察結(jié)果。注意對照組以PBS代替一抗作陰性對照，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)分析，以損傷區(qū)及其周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色的顆粒狀物為陽性反應(yīng)，并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 Western blot法 取出備用的腦組織，稱取100 mg盡量剪碎后勻漿，抽取1 mL加入蛋白裂解液2 mL，離心去上清，加入3%SDS，封口，沸水中加入變性。隨后進(jìn)行蛋白定量，配制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。隨后轉(zhuǎn)膜1 h（100 V，350 mA），在轉(zhuǎn)印的醋酸纖維素膜上分別加FGFR1抗體4℃，過夜。用TBST沖洗3次，每次5 min。加1∶3 000稀釋的FGFR1溫孵育2 h，再用TBST沖洗3次，每次5 min，發(fā)光并顯色（全自動顯影系統(tǒng)型號：柯達(dá)KADOK Image station440）。bFGF的相對含量用條帶積分光密度值（integrate optical density，IOD）來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0及Image-Pro Plus 6.0分析統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化SABC染色結(jié)果

對照組大腦皮層偶見散在的陽性反應(yīng)，陽性物質(zhì)位于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核。腦挫傷后6 h陽性細(xì)胞數(shù)開始增多，3 d達(dá)峰值，7 d已開始下降，但陽性細(xì)胞數(shù)仍多于對照組，見圖1。高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。傷后6 h陽性細(xì)胞計數(shù)較對照組顯著增多（P<0.05）。傷后3 d組bFGF陽性細(xì)胞計數(shù)達(dá)到高峰，隨后表達(dá)降低，但傷后7 d仍維持在較高水平。

表1 大鼠腦挫傷后不同時段bFGF陽性細(xì)胞計數(shù)（±s）

表1 大鼠腦挫傷后不同時段bFGF陽性細(xì)胞計數(shù)（±s）

注：與對照組比較，*P<0.001；與前一組比較，#P＜0.001

組別例數(shù) 陽性細(xì)胞數(shù)對照組1 h組6 h組12 h組1 d組2 d組3 d組7 d組8 8 8 8 8 8 8 8 8.20±0.45 9.80±0.781 13.25±0.45*#27.44±0.22*#42.44±0.23*#47.60±0.25*50.44±0.44*14.42±0.26*

2.2 Western blot結(jié)果

應(yīng)用Western blot檢測法檢測見，損傷組6 h組條帶已經(jīng)比較清晰，且明顯寬于1 h組，12 h組又進(jìn)一步增寬，1 d組、2 d組條帶與3 d組寬度最寬，7 d組已明顯變窄，但是仍比對照組寬。見圖2。

運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)（BI-2000），鏡下觀察（×400），以損傷部位周圍神經(jīng)元及各類膠質(zhì)細(xì)胞（主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）的細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀產(chǎn)物為陽性，并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，見表1。

由表1數(shù)據(jù)可以看出，各損傷組bFGF陽性細(xì)胞計數(shù)與對照組比較，除1 h組外其余各組與對照組比較，差異均有

以IOD值作為相對含量，見腦挫傷后1 h組與假手術(shù)對照組比較略有增高，6 h表達(dá)開始增多，3 d達(dá)到高峰，隨后下降，至7 d時仍高于對照組水平。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，除1 h組外不同時間段各損傷組與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。任意兩實(shí)驗(yàn)組之間兩兩比較，除1、2、3 d組間差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）外，其余各組組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 見表 2。

表2 大鼠腦挫傷后不同時段bFGF的IOD值（±s）

表2 大鼠腦挫傷后不同時段bFGF的IOD值（±s）

注：與對照組比較，#P<0.05；與前一組比較，*P<0.05

組別例數(shù)IOD值對照組1 h組6 h組12 h組1 d組2 d組3 d組7 d組8 8 8 8 8 8 8 8 14 727.18±355.746 17 959.30±2 013.615 31 397.61±2 159.613#*42 343.77±1 119.144#*56 170.83±2 877.773#55 259.44±1 911.650#58 499.06±994.989#22 889.43±2 754.905#

3 討論

顱腦損傷在意外、交通事故以及暴力性損傷中居首位，對于該損傷的早期時間的推斷也一直成為法醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問題。據(jù)有關(guān)研究表明，大腦組織挫傷后，較易形成腦組織局部缺血缺氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生物化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而引發(fā)了一系列應(yīng)激反應(yīng)[3-5]，許多細(xì)胞因子及生物活性物質(zhì)均參與了腦損傷后的修復(fù)過程。據(jù)Finklestein等[6]研究，腦損傷后，bFGF的表達(dá)和分布具有一定的規(guī)律性和特征性變化。bFGF作為多肽神經(jīng)生長因子和促分裂因子，在腦組織中廣泛分布，可能與神經(jīng)的營養(yǎng)再生、創(chuàng)傷愈合等密切相關(guān)，能保護(hù)神經(jīng)元對抗損害，可以防治及減少神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷，使病理狀態(tài)的神經(jīng)元生存，而修復(fù)的神經(jīng)元又可以產(chǎn)生很多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，進(jìn)而加快腦損傷后的修復(fù)過程，這可能就是bFGF在腦損傷后早期表達(dá)的意義。正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中bFGF主要來自星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS）。平時腦組織中含有較低含量的bFGF，其主要作用是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能并延緩細(xì)胞老化[7]。

本研究中采用SABC法及Western blot法檢測大鼠腦挫傷后不同時段腦組織中bFGF的含量，探討bFGF在腦挫傷發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果顯示兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，均表現(xiàn)出先逐漸升高，達(dá)到峰值后又逐漸下降的趨勢，即bFGF在腦組織中的表達(dá)傷后6 h開始增多，3 d達(dá)峰值，7 d已開始下降，但仍高于對照組。該結(jié)果表明大鼠腦挫傷后6 h表達(dá)開始逐漸增多，24 h表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)，3 d達(dá)到峰值，然后開始下降，到7 d時仍未恢復(fù)正常。BFGF在腦挫傷后的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，在腦損傷后6 h表達(dá)明顯增強(qiáng)，3 d達(dá)高峰，隨后即下降，這種趨勢估計與它的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。由于bFGF是通過其受體才能發(fā)揮作用的，而bFGF受體是一種雙重受體系統(tǒng)：即低親和力受體和高親和力受體兩種。其機(jī)制為bFGF須先與低親和力受體結(jié)合，構(gòu)型改變后才能與高親和力受體結(jié)合，激活高親和力受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶的活性，促進(jìn)受體及其底物磷酸化，完成細(xì)胞外信息向胞內(nèi)的傳遞，從而使其發(fā)揮生物學(xué)作用[8]，所以在腦挫傷后的6 h內(nèi)表達(dá)不明顯，后隨著時間延長，低親和力受體在這段時間內(nèi)充分改變構(gòu)型與高親和力受體結(jié)合，使其在之后的時間表達(dá)明顯增加。這種受體學(xué)說與本實(shí)驗(yàn)中bFGF的表達(dá)趨勢吻合。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了bFGF參與腦損傷后的修復(fù)過程，并與腦挫傷經(jīng)過時間有一定的關(guān)聯(lián)性，可見機(jī)體對腦損傷存在自身的保護(hù)機(jī)制，其表達(dá)的時序性的改變有望用于法醫(yī)鑒定中對于腦損傷經(jīng)歷時間的推斷。本文只是對大鼠進(jìn)行了腦挫傷后不同時段腦組織中bFGF的含量變化的初步研究，為今后法醫(yī)學(xué)中損傷時間推斷提供了一定的依據(jù)。此外可與其他一些敏感指標(biāo)聯(lián)合判斷、綜合分析，從而更加準(zhǔn)確地推斷早期的腦損傷時間。

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The inference study on the change of the expression of basic fibroblast growth factor and the time after brain contusion in rats

JIA Meijuan LIANG Xinhua JIAO Yan
School of Law Medicine,Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China

Objective To study the temporality expression rule of basic fibroblast growth factor after brain contusion in rats,and to investigate the relationship between the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF)and the time after brain contusion,in order to provide scientific evidence for practice of legal medicine to conclude the time of inchoate brain contusion.Methods 64 adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 8 groups(7 of experiment groups and 1 of control group).The rats in experiment group were divided into 7 groups after contusion injury which was performed by the drop method with Feeney's way:1 h group,6 h group,12 h group,1 d group,2 d group,3 d group,7 d group.Immunohistochemistry and Western blot were used to study the expression levels of bFGF in brain tissue of rats.Results Positive cells increased at 6 hours after brain injury,the most prominent was at third days after contusion injury,and decreased at 7 days after brain injury,but it was more than basal levels.Conclusion There is temporality regular between the expression of bFGF and the time after brain contusion in rats,this regularity can provide experiment evidence for practice of legal medicine to conclude the time of inchoate brain contusion.

Legal medicine;bFGF;The time of brain contusion;Western blot;SABC

R318

A

1673-7210（2012）08（b）-0016-03

賈美娟（1984-），女，漢族，山西長治人，碩士研究生；研究方向：臨床法醫(yī)學(xué)。

焦炎，男，漢族，山西太原人，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事臨床法醫(yī)學(xué)的教學(xué)、研究和檢案工作。

2012-03-02 本文編輯：衛(wèi) 軻）