HRM技術(shù)在瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性與肝硬化發(fā)生相互關(guān)系研究中的應(yīng)用*

李善高, 曹海軍, 劉 軍, 徐國(guó)萍, 孫明洪, 朱孝鴻, 呂 賓, 孟立娜

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 3 檢驗(yàn)科， 4肝病科，浙江 杭州 310006；2中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)

1000-4718(2012)07-1308-06

2011-12-20

2012-03-08

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y2100379)

△通訊作者 Tel:0571-86919331;E-mail:galisga@yahoo.com.cn

HRM技術(shù)在瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性與肝硬化發(fā)生相互關(guān)系研究中的應(yīng)用*

李善高1△, 曹海軍1, 劉 軍2, 徐國(guó)萍1, 孫明洪3, 朱孝鴻4, 呂 賓1, 孟立娜1

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院1消化內(nèi)科，3檢驗(yàn)科，4肝病科，浙江 杭州 310006；2中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)

目的探討PCR-高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術(shù)篩選和分析肝硬化患者瘦素基因啟動(dòng)子C2549和G2548位點(diǎn)突變的可能性，同時(shí)研究突變基因型與肝硬化患者生理生化指標(biāo)之間的關(guān)系。方法采用PCR-HRM新型技術(shù)，同時(shí)對(duì)比傳統(tǒng)方法PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)，對(duì)對(duì)照組(n=100)和肝硬化組(n=100)瘦素基因啟動(dòng)子C2549和G2548位點(diǎn)突變進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)生理生化指標(biāo)。結(jié)果(1)PCR-HRMA技術(shù)能夠有效、高通量、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性的檢測(cè)； (2)肝硬化患者瘦素基因啟動(dòng)子主要突變位點(diǎn)在C2549，而G2548位點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)突變；(3)肝硬化組中瘦素、游離瘦素指數(shù)(FLI)、空腹胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)高于對(duì)照組，胰島素敏感指數(shù)(ISI)及可溶性瘦素受體(sOB-R)低于對(duì)照組，除瘦素外，均有顯著差異(P<0.05)；FLI與FINS和HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.45、r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.34,P<0.05)；(4)肝硬化患者C2549雜合型占優(yōu)勢(shì)，肝硬化純合型和雜合型突變個(gè)體中 HOMI-IR、瘦素、sOB-R及FLI均高于野生型，除瘦素及sOB-R外均有顯著差異(P< 0.05)。結(jié)論P(yáng)CR-HRM能準(zhǔn)確及高通量地實(shí)現(xiàn)對(duì)瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性進(jìn)行分析，并驗(yàn)證了A位點(diǎn)基因頻率的增高可能和肝硬化發(fā)生有關(guān)；肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗，瘦素可能與肝硬化患者胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)。

高分辨率熔解曲線分析； 瘦素; 基因啟動(dòng)子； 基因多態(tài)性； 肝硬化

瘦素(leptin，Lp)是一種由脂肪組織分泌的激素，參與脂肪及能量代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)體重。該編碼基因由于其啟動(dòng)子區(qū)在C2549和C2548位點(diǎn)存在多態(tài)性，這些位點(diǎn)突變往往和瘦素調(diào)控的相關(guān)疾病發(fā)生有關(guān)[1-2]，但往往由于篩查方法采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技術(shù)，很難進(jìn)行高通量的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，難以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)論。本研究試圖通過(guò)PCR-高分辨率熔解曲線分析(high-resolution mel-ting curve analysis)，同時(shí)結(jié)合生理生化指標(biāo)的檢測(cè)分析，以期篩選出與肝硬化發(fā)生相關(guān)的瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)，同時(shí)通過(guò)該方法得出基因型個(gè)體與瘦素相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

收集從2010年3月至2011年9月來(lái)我院就診的乙肝后肝硬化患者100例(肝硬化組)，男性61例，女性39例，年齡37～75歲，平均年齡(54.12±10.13 )歲，均符合2000年9月西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)。血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)均陽(yáng)性，并排除糖尿病、腎病、心臟病、腫瘤、艾滋病、梅毒及合并嚴(yán)重感染影響激素代謝的疾病。對(duì)照組100例，男性69例，女性31例，年齡35～74歲，平均年齡(55.20±8.75)歲，為我院同期健康體檢者，均排除各種病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝的健康人群。2組間在性別、年齡和體重指數(shù)上相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。以上研究對(duì)象均為漢族，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。本研究方案由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，受檢者均知情同意。

2方法

2.1生理生化指標(biāo)測(cè)定 隔夜空腹8 h以上抽取肘靜脈血，檢測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和空腹胰島素(fasting insulin,FINS)。同時(shí)取靜脈血2 mL，離心后取上清，放置于-80 ℃冰箱里保存，待測(cè)血清Lp、可溶性瘦素受體(soluble leptin receptor,sOB-R)。FPG及FINS檢測(cè)均采用雅培貿(mào)易(上海)有限公司提供檢測(cè)試劑盒檢測(cè)；其中，F(xiàn)PG采用己糖激酶法檢測(cè)，F(xiàn)INS采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法檢測(cè)；Lp檢測(cè)采用上海研生生化試劑有限公司提供的人瘦素ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)；sOB-R檢測(cè)采用上海優(yōu)研生化試劑有限公司提供的人可溶性瘦素受體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。測(cè)體重及身高，體重指數(shù)(body mass index,BMI)=體重(kg)/[身高(m)]2，胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index was estimated by homeostatic model assessment,HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5，胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)=1/ FPG×FINS，游離瘦素指數(shù)(free leptin index,FLI)=Lp/sOB-R。

2.2血液基因組DNA提取 晨抽取空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，采用血液基因組DNA提取試劑盒(杭州浩基生物科技有限公司)進(jìn)行提取，溶解于10 mmol/L Tris(pH 8.0)中，紫外分光光度計(jì)和電泳分析DNA的含量及完整性。

2.3PCR-HRM擴(kuò)增分析 根據(jù)人瘦素基因啟動(dòng)子序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR-HRM引物，其正反向序列分別是5'-GGCTTTCTAAGCCAAGGCAAAA-3'和5'-GCAACATCTCAGCACTTAGGGAG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為222 bp。PCR采用2×SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，反應(yīng)體系：2×SsoFast EvaGreen Supermix 10 μL，10 μmol/L正向和反向引物 1 μL，50 ng模板基因組DNA，加入去離子水定容到20 μL。反應(yīng)條件：98 ℃，變性30 s，98 ℃ 5 s、60 ℃ 退火/延伸10 s(收集熒光信號(hào))，循環(huán)40次，隨后98 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，在70 ℃～90 ℃之間，每隔10 s上升0.2 ℃，進(jìn)行熔點(diǎn)曲線的制作。該擴(kuò)增采用CFX96 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)完成，隨后采用Precision Melt軟件進(jìn)行校正標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；PCR產(chǎn)物送往上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.4PCR-RFLP方法 傳統(tǒng)方法采用PCR-RFLP技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA片段并進(jìn)行基因分型，其正向和反向序列分別為：5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3' 和5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，具體擴(kuò)增條件和體系參照文獻(xiàn)[3]。PCR擴(kuò)增采用2×PCR Master Mix(杭州浩基生物科技有限公司)，簡(jiǎn)單如下：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L正向引物和10 μmol/L反向引物分別是0.5 μL，50 ng基因組DNA，最后加入去離子水定容到25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次。242 bp PCR產(chǎn)物經(jīng)CfoI(HhaI)(Roche)37 ℃消化2 h，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析及基因分型。當(dāng)基因型為AA時(shí)，2個(gè)等位基因均有切點(diǎn)，酶切后有181 bp和61 bp 2條帶；CC基因型時(shí)，2個(gè)等位基因均無(wú)切點(diǎn)，酶切后為242 bp 1條帶；AC基因型時(shí)，一個(gè)等位基因有切點(diǎn)，另一個(gè)等位基因無(wú)切點(diǎn)，酶切后為242 bp、181 bp和61 bp 3條帶。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1肝硬化組和正常組生理生化指標(biāo)

肝硬化組總Lp、經(jīng)BMI調(diào)整后Lp、FLI、FINS及HOMI-IR高于對(duì)照組，ISI及sOB-R低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。FLI與FINS及HOMI-IR呈正相關(guān)(r=0.45,r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.34,P<0.05)，說(shuō)明肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗；Lp生物學(xué)活性與肝硬化患者胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)。

按性別分類，無(wú)論是肝硬化組還是正常組，女性Lp、sOB-R及FLI均高于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但男性肝硬化患者Lp水平同男性對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2血液基因組DNA提取結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)提取的血液基因組DNA，A260/280比值均在1.6～1.8之間，濃度為50～100 mg/L，1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明提取的DNA是完整的，隨機(jī)選擇基因組DNA電泳結(jié)果見圖1。

表1對(duì)照組和肝硬化組生理生化指標(biāo)比較

IndexCirrhosisControlSex(male/female)61/3969/31Age(year)54.12±10.1355.20±8.75BMI(kg/m2)22.52±3.2023.07±7.13FPG(mmol/L)5.67±1.645.21±1.07FINS(U/L)14.11±7.92**5.63±3.42HOMA-IR3.55±1.36**1.30±0.52ISI0.01±0.01**0.03±0.02LP(ng/L)16.92±9.03**11.76±8.41 Male10.72±8.68(n=61)8.63±7.21(n=69) Female26.64±7.38**△△(n=39)18.73±9.22△△(n=31)Lp/BMI(ng·L-1·kg-1·m2)0.73±0.42**0.51±0.33sOB-R(ng/L)5.63±2.13**8.18±3.22 Male4.36±2.21**(n=61)6.39±3.72(n=69) Female7.91±3.50**△△(n=39)12.09±4.77△△(n=31)FLI3.01±2.78**1.44±0.98 Male2.46±0.72**(n=61)1.35±0.88(n=69) Female3.37±1.29**△△(n=39)1.55±0.88△△(n=31)

BMI: body mass index; FPG: fasting plasma glucose; FINS: fasting insulin; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index；Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptor; FLI: free leptin index.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmale in the same group.

Figure 1. Electrophoresis analysis of genomic DNA isolated from blood in control and liver cirrhosis patients.M:DNA marker.

圖1正常組和肝硬化組隨機(jī)血液樣品基因組DNA電泳結(jié)果

3PCR-HRM3種基因型的擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)對(duì)收集樣品瘦素基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR-HRM擴(kuò)增，然后采用Precision Melt軟件(Bio-Rad)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(normalized melting curve)和差異曲線(difference curve)分析，能夠很明顯地分為3種類型，然后對(duì)這3種類型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC野生型、AA純合型和CA雜合型3種基因型，見圖2。對(duì)這3種基因型擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這一突變發(fā)生在2 549位上，而不是發(fā)生在2 548位上，這表明2 549位的堿基突變與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

4PCR-RFLP3種基因型的分析結(jié)果

對(duì)PCR-HRM擴(kuò)增結(jié)果得到的3種基因型，通過(guò)PCR-RFLP方法進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果表明PCR-HRM方法鑒定得到的CC野生型，采用PCR-RFLP酶切后出現(xiàn)了242 bp的條帶，AA純合型出現(xiàn)了181 bp和61 bp 2條帶，CA雜合型出現(xiàn)了242 bp、181 bp和61 bp 3條帶,見圖3。

Figure 2. Curves and sequencing results of PCR-HRM products from the three genotypes.A: normalized melting curves of PCR-HRM amplification; B: difference curves of PCR-HRM amplification；C: sequencing results of PCR-HRM products.

圖23種基因型PCR-HRM擴(kuò)增結(jié)果

Figure 3. Electrophoresis analysis of PCR-RFLP in the three genotypes.M:DNA marker.

圖33種基因型PCR-RFLP產(chǎn)物電泳分析結(jié)果

5PCR-RFLP和PCR-HRM2種方法分析樣品瘦素基因啟動(dòng)子基因型

通過(guò)對(duì)100例正常組和100例肝硬化組樣品，分別采用PCR-RFLP和PCR-HRM 2種方法對(duì)瘦素基因啟動(dòng)子基因進(jìn)行分型，3種基因型的分析鑒定結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)，該結(jié)果表明2種基因分析方法對(duì)瘦素基因啟動(dòng)子多態(tài)性C2549檢測(cè)具有較好的一致性，說(shuō)明采用PCR-HRM方法能夠準(zhǔn)確、高通量實(shí)現(xiàn)對(duì)肝纖維化中2 549位點(diǎn)突變的檢測(cè)和分析。分析結(jié)果表明：肝硬化組A堿基突變頻率明顯高于對(duì)照組(P< 0.05)，并以C2549雜合型個(gè)體占優(yōu)勢(shì)(P<0.05)，見表2。

6肝硬化組基因型與生理生化指標(biāo)的關(guān)系

肝硬化組純合和雜合型突變個(gè)體的HOMI-IR、Lp、sOB-R及FLI指標(biāo)值均高于野生型，除Lp及sOB-R外，其余指標(biāo)值均有顯著差異(P< 0.05)，見表3。這表明C2549A突變可能與肝硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

表2 PCR-RFLP和PCR-HRM瘦素基因啟動(dòng)子C2549位點(diǎn)基因檢測(cè)結(jié)果比較

△P<0.05vsnormal.

表3 肝硬化組不同基因型生理生化指標(biāo)比較

BMI: body mass index; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index; Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptors; FLI: free leptin index.△P<0.05vswildtype(CC).

討 論

Lp是作為脂肪細(xì)胞分泌的一種激素，能夠廣泛參與脂肪代謝和能量代謝，該基因位于染色體7q31.3，為單拷貝基因。該基因啟動(dòng)子區(qū)存在C2549和G2548兩個(gè)可能的突變位點(diǎn)，本研究初步發(fā)現(xiàn)C2549A突變和肝硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這和國(guó)內(nèi)外的研究相一致[4-5]。

和傳統(tǒng)PCR-RFLP技術(shù)相比，新穎的PCR-HRM技術(shù)是一種新型的突變篩選和分析技術(shù)，該技術(shù)能夠通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值0.2 ℃的差別很容易鑒定出野生型和突變個(gè)體，利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了腫瘤發(fā)生相關(guān)突變、微生物突變等的快速檢測(cè)和分析，而且該技術(shù)快捷、高通量以及靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)成為未來(lái)基因突變檢測(cè)分析的重要手段之一[6-7]。本研究中采用PCR-HRM技術(shù)，同時(shí)對(duì)比PCR-RFLP方法，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)瘦素基因啟動(dòng)子C2549A突變進(jìn)行準(zhǔn)確、高通量分析，同時(shí)簡(jiǎn)易的操作方法便于基層醫(yī)療檢測(cè)部門進(jìn)行C2549A分型與肝硬化易感預(yù)測(cè)分析。

在肝硬化組中，Lp水平高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異；與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。而男女個(gè)體中，女性Lp水平明顯高于男性，這一現(xiàn)象可能與雌激素影響細(xì)胞因子的釋放有關(guān)[9]。sOB-R是主要的Lp結(jié)合蛋白，Lp在體內(nèi)生物學(xué)活性與體內(nèi)總Lp無(wú)關(guān)，F(xiàn)LI是代表Lp在體內(nèi)生物學(xué)活性的指標(biāo)[10-11]，本研究中，sOB-R水平在肝硬化組患者中明顯減少，F(xiàn)LI明顯高于對(duì)照組，F(xiàn)LI與FINS及HOMI-IR呈正相關(guān)(r=0.45，r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.34,P<0.05)，說(shuō)明肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗；Lp生物學(xué)活性與肝硬化患者胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)。

肝硬化患者中，C2549A純合突變型和雜合突變型FLI及HOMI-IR高于野生型，C2549A雜合突變的基因頻率明顯高于野生型(P< 0.05)，這一結(jié)果推測(cè)由于C2549突變導(dǎo)致基因啟動(dòng)子雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，尤其C2549雜合突變，利于與Lp相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合，導(dǎo)致Lp蛋白的大量表達(dá)；該蛋白進(jìn)而通過(guò)和其受體的結(jié)合，激活下游JAK/STAT和TGF-β/Smads等信號(hào)通路，最終促使肝纖維化、肝硬化的發(fā)生發(fā)展。因此，收集更多不同省份、不同人種的肝硬化患者血清樣品，采用PCR-HRM方法進(jìn)一步進(jìn)行C2549A位點(diǎn)突變與肝硬化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性分析，為從瘦素啟動(dòng)子突變來(lái)研究肝硬化的發(fā)病機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

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ApplicationofPCR-HRMinthestudyofrelationshipbetweenleptingenepromoterpolymorphismsandlivercirrhosis

LI Shan-gao1, CAO Hai-jun1, LIU Jun2, XU Guo-ping1, SUN Ming-hong3, ZHU Xiao-hong4, Lü Bin1, MENG Li-na1

(1DepartmentofGastrointestinalMedicine,3DepartmentofLaboratoryMedicine,4DepartmentofHepatopathy,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;2CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China.E-mail:galisga@yahoo.com.cn)

AIM: To analyze the feasibility of PCR-high-resolution melting curve analysis (HRM) for detecting the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter from the patients with liver cirrhosis, and to explore the relevance between mutant genotypes and physiological and biochemical indexes in liver cirrhosis patients.METHODSCompared with the method of PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), the present research used the method of PCR-HRM to analyze the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter in control group (n=100) and liver cirrhosis group (n=100). The physiological and biochemical indexes of the patients were also detected and compared.RESULTSLeptin gene promoter polymorphism was detected using PCR-HRM with effectiveness, high flux and accuracy. Preliminary results showed that the main mutation of the patients with liver cirrhosis was in C2549 site, but not found in G2548 site. Leptin, free leptin index (FLI), fasting insulin (FINS) and insulin resistance index estimated by homeostatic model assessment (HOMA-IR) in liver cirrhosis group were higher than those in control group. Insulin sensitivity index (ISI) and soluble leptin receptor (sOB-R) in liver cirrhosis group were lower than those in control group with significant difference except leptin level. Meanwhile, FLI showed positively correlated with FINS and HOMA-IR (r=0.45,r=0.53,P<0.05), and negatively with ISI (r=-0.34,P<0.05). In the patients with liver cirrhosis, C2549A heterozygous mutation was predominant. The indexes of HOMI-IR, leptin, sOB-R and FLI of C2549A homozygotes and heterozygotes were higher than those of the wildtypes, which showed significant difference except leptin and sOB-R levels (P<0.05).CONCLUSIONPCR-HRM can be more accurate for identifying leptin promoter polymorphism. The increase in the frequency of C2549A mutation may be closely related with liver cirrhosis. Existence of hyperinsulinemia and insulin resistance may be correlated with leptin level in the patients with liver cirrhosis.

High-resolution melting curve analysis; Leptin; Promoter,genetic; Polymorphism,genetic; Liver cirrhosis

R446.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.029