L-carnosine對NIT-1胰島細(xì)胞的影響及機(jī)制*

周莉莉， 桂書彥， 楊 雁， 袁 剛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科, 湖北 武漢 430030)

1000-4718(2012)07-1281-06

2012-01-05

2012-04-01

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81100582)

△通訊作者 Tel: 027-83663331; E-mail:yuangang88@hotmail.com

L-carnosine對NIT-1胰島細(xì)胞的影響及機(jī)制*

周莉莉， 桂書彥， 楊 雁， 袁 剛△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科, 湖北 武漢 430030)

目的研究肌肽(L-carnosine)對高糖培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞胰島素分泌、增殖和凋亡的影響及機(jī)制。方法(1)正常和高糖培養(yǎng)細(xì)胞72 h，放射免疫法測定葡萄糖刺激的胰島素分泌，然后分別換不同濃度葡萄糖和L-carnosine培養(yǎng)，測定胰島素分泌；(2)細(xì)胞分為C組(11.1 mmol/L glucose)、H組 (33.3 mmol/L glucose)、H+A組(33.3 mmol/L glucose +1 mmol/L L-carnosine)和H+B(33.3 mmol/L glucose+ 20 mmol/L L-carnosine)組培養(yǎng)72 h，BrdU檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，RT-PCR測定bcl-2和caspase-3 mRNA的表達(dá)，熒光法檢測caspase-3活性。結(jié)果(1)高糖組細(xì)胞胰島素分泌減少； 20 mmol/L L-carnosine顯著增加正常和高糖組胰島素分泌(P<0.01)，且呈正相關(guān)(P<0.01)；(2)高糖組細(xì)胞增殖和凋亡均增加(均P<0.01)，但總體數(shù)目減少；1 mmol/L L-carnosine使增殖增加，凋亡減少(P<0.01)；(3) 高糖組caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增加,bcl-2 mRNA明顯減少(P<0.05)；1 mmol/L L-carnosine使前者明顯減少(P<0.05)，后者明顯增加(P<0.01)；不同濃度L-carnosine均明顯降低caspase-3活性。結(jié)論高濃度L-carnosine可單獨刺激細(xì)胞分泌胰島素，低濃度的L-carnosine可增加NIT-1細(xì)胞增殖并減少高濃度葡萄糖所導(dǎo)致的凋亡。Caspase-3和Bcl-2可能參與了L-carnosine保護(hù)NIT-1細(xì)胞的過程。

肌肽; 葡萄糖; 胰島素; 細(xì)胞凋亡; NIT-1細(xì)胞

近年來，2型糖尿病發(fā)病率逐漸增加，其確切發(fā)病機(jī)制還不清楚。新近研究顯示，肌肽酶1 (carnosinase 1，CN1)與糖尿病及糖尿病腎病明顯相關(guān)[1]。CN1是一種二肽酶，可以水解β-丙氨酰-L-組氨酸，或稱肌肽(L-carnosine)，從而降低L-carnosine的血漿濃度。CN1基因序列上有1個亮氨酸重復(fù)序列，研究發(fā)現(xiàn)，不同數(shù)量的亮氨酸重復(fù)序列所表達(dá)的CN1的活性不同，亮氨酸重復(fù)序列越多，CN1活性越高，同時糖尿病腎病的發(fā)病率也越高[2]。大于5個亮氨酸重復(fù)序列的病人發(fā)生糖尿病腎病的危險性明顯增加。由于高活性的CN1可以導(dǎo)致L-carnosine的濃度下降，因此，L-carnosine可能同樣與糖尿病有關(guān)，并且可能是糖尿病的一種保護(hù)因子[3]。Sibylle等[4]研究中，觀察到L-carnosine能改善糖尿病實驗動物的胰島素水平，胰腺病理檢查提示胰島體積明顯增加,并在細(xì)胞實驗中觀察到一定濃度的L-carnosine可以促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制不清，推測是否與其影響胰島細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。

在細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3的激活是凋亡級聯(lián)反應(yīng)終末事件，激活后形成的級聯(lián)反應(yīng)最終將DNA剪切成寡核苷酸片段，細(xì)胞凋亡。而Bcl-2作為一種重要的抗凋亡蛋白發(fā)揮著抑制細(xì)胞凋亡、保存細(xì)胞的作用。

本研究觀察L-carnosine在高糖環(huán)境中對β細(xì)胞以及相關(guān)的基因表達(dá)的影響，探討其改善血糖的機(jī)制，為其以后的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

NIT-1細(xì)胞(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系提供)采用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。預(yù)先使用11.1 mmol/L和33.3 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)NIT-1細(xì)胞，以模擬高糖環(huán)境，然后分別轉(zhuǎn)換成含不同濃度的L-carnosine和葡萄糖的培養(yǎng)基，進(jìn)行實驗。

2細(xì)胞分組

分別給予葡萄糖11.1 mmol/L(C組)和33.3 mmol/L(H組)，24孔板預(yù)培養(yǎng)72 h。

2.124孔板細(xì)胞分別用不同濃度葡萄糖(0 mmol/L、5 mmol/L和25 mmol/L)刺激，放射免疫法測定胰島素分泌(操作步驟見試劑盒說明書)，檢測葡萄糖對NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的影響，以確定細(xì)胞具備葡萄糖依賴的胰島素分泌能力。

2.224孔板細(xì)胞分別用含不同濃度葡萄糖和L-carnosine的KRBB液(含0.2%BSA)培養(yǎng)(0 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、0 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine、0 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine、25 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、25 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine和25 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine)，收集上清用放射免疫試劑盒測定胰島素，檢測L-carnosine對NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的影響。

3L-carnosine對NIT-1胰島細(xì)胞增殖和凋亡影響

3.1NIT-1細(xì)胞分4組 C組：11.1 mmol/L glucose；H組：33.3 mmol/L glucose；H+A組：33.3 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine；H+B組：33.3 mmol/L glucose +20 mmol/L L-carnosine，培養(yǎng)72 h。

3.2BrdU測定NIT-1細(xì)胞的增殖 24孔板細(xì)胞加BrdU(10 μmol/L)培養(yǎng)基，于37 ℃含5% CO2的溫箱中孵育30 min；PBS漂洗，70%乙醇于-20 ℃冰箱固定1 h，按羅氏BrdU試劑盒流程操作，最后DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色,代表細(xì)胞總數(shù)，BrdU標(biāo)記的細(xì)胞核呈綠色,代表陽性細(xì)胞數(shù)，計數(shù)1 000個細(xì)胞，求出陽性細(xì)胞百分率。

3.3流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測細(xì)胞凋亡 12孔板細(xì)胞用胰酶消化收集至EP管，離心后PBS混懸細(xì)胞，按凱基流式細(xì)胞檢測流程操作，收集上清于Beckman流式細(xì)胞儀分析,凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)用Annexin Ⅴ+/PI-+ Annexin Ⅴ+/PI+表示。

3.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 12孔板細(xì)胞提取總RNA,將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA， caspase-3(202 bp)引物 5′-TCTGACTGGAAAGCCGAACA-3′和5′-CTGGATGAACCACGACCC-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min熱啟動,94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循環(huán)33次。bcl-2(190 bp)引物5′-ATGCGTCCACCAAGAA-3′和5′-GTAGAAGAGGGCACCAC-3′。 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min熱啟動,94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循環(huán)35次。β-actin(216 bp)引物5′-GAAATCGTGCGTGACATCAAAG-3′和5′- TGTAGTTTCATGGATGCCACAG- 3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min熱啟動,94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳 ,置于凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描(UVP) ,以β- actin作為內(nèi)參照校正。

3.5Caspase-3活性檢測 12孔板細(xì)胞用胰酶消化收集至EP管，離心后PBS洗滌2次，使用熒光法caspase-3活性檢測試劑盒(Biovision)，按照說明操作，酶標(biāo)儀測定405 nm處吸光度(A)值。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1L-carnosine對胰島素分泌的影響

使用11.1 mmol/L和33.3 mmol/L葡萄糖預(yù)培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞均顯示葡萄糖濃度依賴的胰島素釋放,見圖1A。但是與對照組相比，高糖組胰島素分泌明顯降低，提示NIT-1細(xì)胞具備胰島細(xì)胞胰島素分泌特征，長時間高濃度葡萄糖培養(yǎng)降低NIT-1細(xì)胞的胰島素分泌。

在無糖條件下(0 mmol/L葡萄糖)，無論11.1 mmol/L或33.3 mmol/L葡萄糖預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，與無L- carnosine刺激組比較，20 mmol/L L-carnosine均顯著增加胰島素分泌(P<0.01)，而在1 mmol/L L- carnosine組，胰島素分泌稍有增加，但無明顯差異(P>0.05),見圖1B、C；在11.1 mmol/L葡萄糖預(yù)培養(yǎng)組中，20 mmol/L L-carnosine 與1 mmol/L L-carnosine比較，胰島素分泌無顯著差異(P>0.05),見圖1B;而在33.3 mmol/L葡萄糖預(yù)培養(yǎng)組中, 20 mmol/L L-carnosine與1 mmol/L組比較明顯增加胰島素分泌(P<0.01)，見圖1C；在有糖條件(5 mmol/L和25 mmol/L)下，無論用正?；蚋邼舛绕咸烟穷A(yù)先培養(yǎng)的細(xì)胞，1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均不明顯增加胰島素分泌(P>0.05)，見圖1B、C。

2L-carnosine對NIT-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.1BrdU檢測NIT-1細(xì)胞增殖率 圖2顯示,高糖干預(yù)組細(xì)胞增殖率較正常組明顯增加(36.22%vs18.32%,P<0.01)，1 mmol/L L-carnosine培養(yǎng)使增殖率繼續(xù)增加至43.87%(P<0.01)， 而20 mmol/L L-carnosine并不繼續(xù)增加增殖率，與H組比較也不明顯增加(P>0.05)。

圖1L-carnosine對NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的影響

圖2L-carnosine對NIT-1細(xì)胞增殖的影響

2.2AnnexinⅤ-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡 圖3顯示,AnenexinⅤ-/PI-為正常細(xì)胞，AnenexinⅤ+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，AnenexinⅤ+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞，AnenexinⅤ-/PI+為壞死細(xì)胞；AnenexinⅤ+/PI-與AnenexinⅤ+/PI+為總的凋亡細(xì)胞。高糖組細(xì)胞凋亡率為25.19%，明顯高于對照組的6.42%(P<0.01)，且高糖培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢，總體數(shù)量減少；1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均使細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)，且1 mmol/L L-carnosine能使細(xì)胞凋亡減少更低。

圖3L-carnosine對NIT-1細(xì)胞凋亡的影響

2.3RT-PCR檢測caspase-3和bcl-2 mRNA的表達(dá) 圖4顯示，高糖組caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增加,bcl-2 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)；

圖4半定量RT-PCR測定bcl-2和caspase-3mRNA的表達(dá)

1 mmol/L L-carnosine使前者明顯減少(P<0.05)，后者明顯增加(P<0.01)。20 mmol/L L-carnosine對兩者無明顯影響(P>0.05)。

2.4Caspase-3活性檢測 圖5顯示，高糖組caspase-3活性較對照組明顯增加，1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均明顯降低caspase-3活性。

圖5L-carnosine對NIT-1細(xì)胞caspase-3活性的影響

討 論

Hihiko等[5]發(fā)現(xiàn)了雞精的一種有效成分為L-carnosine對糖尿病有利，進(jìn)行了一項對大鼠無麻醉條件下的腹腔注射2-脫氧-D-葡萄糖的實驗，造成體內(nèi)血糖升高，而頭顱和腹腔內(nèi)分別注射L-carnosine均能減少這種高血糖狀態(tài)。L-carnosine廣泛存在于機(jī)體組織的細(xì)胞內(nèi)，在肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最高，分別分泌進(jìn)入血液和腦脊液。在人體內(nèi)，L-carnosine被由肝臟所分泌的CN1所降解。在包括嚙齒類在內(nèi)的其它哺乳動物，CN1主要在腎臟表達(dá)，血漿中水平很低，L-carnosine由腎小球濾過并由腎小管重吸收，在細(xì)胞漿中降解。研究顯示，L-carnosine具有清除活性氧[6]、抑制脂質(zhì)氧化[7]、防止蛋白質(zhì)糖化[8]、調(diào)節(jié)免疫功能[9]以及抗腫瘤[10]和抗衰老等作用[11]。Sauerh?fer等[4]觀察到L-carnosine能改善實驗動物的血糖，增加胰島素水平，胰腺病理檢查提示胰島體積明顯增加，但是具體機(jī)制不清，推測L-carnosine對血糖的影響可能是通過刺激胰島細(xì)胞產(chǎn)生胰島素或者增加胰島細(xì)胞的增殖來實現(xiàn)的。

NOD鼠是廣泛應(yīng)用于糖尿病基礎(chǔ)研究的胰島素依賴性糖尿病模型，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入SV40大T抗原基因后能自發(fā)性產(chǎn)生胰島β細(xì)胞瘤，NIT-1細(xì)胞就是源于這種轉(zhuǎn)基因NODdx鼠的β細(xì)胞[12]。NIT-1細(xì)胞為多邊形上皮樣細(xì)胞，呈簇狀生長，基本保持了小鼠正常胰島β形態(tài)。免疫化學(xué)實驗證實，NIT-1細(xì)胞主要分泌胰島素，只有極少部分的(≤0.5%)細(xì)胞分泌胰高血糖素，其胰島素的基礎(chǔ)分泌情況與正常胰島β細(xì)胞沒有顯著差異。因此，可用NIT-1細(xì)胞替代小鼠正常胰島β細(xì)胞進(jìn)行胰島素依賴性糖尿病的基礎(chǔ)研究。

本實驗使用NIT-1細(xì)胞，研究L-carnosine影響糖尿病的可能機(jī)制。對正常和高糖培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞進(jìn)行了不同刺激物下的胰島素分泌實驗，發(fā)現(xiàn)隨著用于刺激的葡萄糖濃度的增加，NIT-1細(xì)胞胰島素釋放增加，呈劑量依賴性，說明NIT-1細(xì)胞符合胰島β細(xì)胞的特征，可以用于實驗。同時發(fā)現(xiàn)高糖孵育72 h后，細(xì)胞分泌胰島素整體水平均減少，說明高糖使胰島β細(xì)胞功能受損；另外觀察到高濃度L-carnosine能單獨刺激胰島素分泌，但接近生理濃度時并沒有明顯影響胰島素分泌，且在葡萄糖存在的條件下不同濃度L-carnosine對胰島β細(xì)胞分泌胰島素沒有明顯增加，說明高濃度L-carnosine雖然能夠增加胰島素分泌，但此種促分泌作用不能解釋其改善糖尿病大鼠血糖的機(jī)制，應(yīng)該還存在其它方面的機(jī)制。

胰島素的分泌能力取決于胰島β細(xì)胞合適的數(shù)量，這是由β細(xì)胞增殖/壞死和凋亡之間動態(tài)的平衡決定[13]。既往研究顯示長期高血糖的毒性作用，使β細(xì)胞增殖呈一過性增加而凋亡逐漸增加，當(dāng)增殖的增加不足于代償細(xì)胞的凋亡，即發(fā)生β細(xì)胞的丟失[14]。因此我們進(jìn)一步研究了L-carnosine對NIT-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示NIT-1細(xì)胞在慢性高糖作用下，增殖率和凋亡率均明顯增加，但是凋亡超過增殖，說明胰島細(xì)胞仍處于負(fù)增殖狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量總體上有所減少；生理濃度和高濃度的L-carnosine均明顯增加β細(xì)胞增殖，但生理濃度L-carnosine增加更明顯，且高于單獨高血糖的影響。同時各濃度L-carnosine均明顯減少NIT-1細(xì)胞的凋亡，說明L-carnosine使細(xì)胞處于正增殖狀態(tài)，從而增加β細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步改善胰島功能，并且此種作用在生理劑量L-carnosine組更明顯。

高血糖的大鼠模型中觀察到了抗凋亡基因bcl-2的減少和促凋亡基因bax的增加，它們是啟動凋亡過程的執(zhí)行者,前者和后者的比值決定了細(xì)胞是否凋亡[15]。Caspase-3的激活是凋亡級聯(lián)反應(yīng)終末事件，激活后形成的級聯(lián)反應(yīng)最終將DNA剪切成寡核苷酸片段。為了觀察這2種基因是否也參與了L-carnosine改善胰島細(xì)胞增殖和凋亡的過程，我們分別測定不同組別中兩者的表達(dá)量，結(jié)果顯示高糖組caspase-3表達(dá)和活性較對照組增加(P<0.05)，抗凋亡基因bcl-2活性則下降(P<0.05)；與高糖組H相比，生理濃度的L-carnosine(1mmol/L)能抑制凋亡蛋白caspase-3 mRNA的表達(dá)和活性(P<0.01)，增加抗凋亡蛋白bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，說明caspase-3和Bcl-2可能參與了高糖條件促進(jìn)NIT-1細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，以及L-carnosine可能通過對caspase-3和Bcl-2的影響來調(diào)節(jié)β細(xì)胞的增殖和凋亡。但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

新近研究[16]顯示L-carnosine也可通過增加肝臟糖原合成酶2、葡萄糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2的表達(dá)來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，提示L-carnosine對糖尿病還存在胰島外的作用。并且L-carnosine還可能抑制糖基化終末產(chǎn)物的形成，從而改善糖尿病的慢性并發(fā)癥如糖尿病腎病[17]和視網(wǎng)膜病變等[18]。

L-carnosine基本組成成分為丙氨酸和組氨酸，另有研究發(fā)現(xiàn)丙氨酸能有效地刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素，其作用可能是協(xié)同葡萄糖的代謝或在自身代謝過程中產(chǎn)生促分泌偶聯(lián)因子如谷氨酸等[19]，這些可能也參與L-carnosine對糖尿病的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度L-carnosine能直接刺激β細(xì)胞胰島素分泌，但其作用小于葡萄糖的刺激作用；同時L-carnosine能增加胰島細(xì)胞的增殖，減少高血糖所導(dǎo)致的凋亡，增加胰島細(xì)胞的數(shù)量，其機(jī)制可能部分為影響B(tài)cl-2及caspase-3表達(dá)。

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EffectsofL-carnosineonNIT-1isletcells

ZHOU Li-li, GUI Shu-yan, YANG Yan, YUAN Gang

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430030,China.E-mail:yuangang88@hotmail.com)

AIM: To investigate the protective effect of L-carnosine on insulin secretion, proliferation and apoptosis of β-cells impaired by high glucose.METHODSNIT-1 cells were pre-treated with glucose at concentrations of 11.1 mmol/L (control level) and 33.3 mmol/L (high level) for 72 h, and then the cells were stimulated with various concentrations of glucose (0, 5 and 25 mmol/L) and/or L-carnosine (0, 1 and 20 mmol/L). The level of insulin in the medium was measured by radioimmunoassay. To detect the effect of L-carnosine on proliferation and apoptosis, NIT-1 cells were divided into 4 groups according to different culture conditions for 72 h: group C (with 11.1 mmol/L glucose), group H (with 33.3 mmol/L glucose), group H+A (with 33.3 mmol/L glucose+ 1 mmol/L L-carnosine) and group H+B (with 33.3 mmol/L glucose +20 mmol/L L-carnosine). Proliferous or apoptotic cells were identified by BrdU labeling and flow cytometry (labeling with annexin V-FITC/PI),respectively. Total RNA was extracted and the mRNA expression of caspase-3 and bcl-2 was measured by RT-PCR. The caspase-3 activity was also checked by fluorometric assay kit.RESULTSThe insulin in high-level glucose group was lower than that in control-level glucose group. L-carnosine at concentration of 20 mmol/L notably increased the insulin secretion of the cells pre-treated with glucose at control level or high level. The proliferation and apoptosis were both increased in group H compared with group C, but the total cell counts declined because the apoptotic rate was higher than the proliferation rate. L-carnosine at concentration of 1 mmol/L significantly increased the proliferation rate and decreased the apoptotic rate. The mRNA level of caspase-3 was decreased and the mRNA level of bcl-2 was increased after the cells were treated with L-carnosine at concentration of 1 mmol/L. L-carnosine at concentrations of both 1 mmol/L and 20 mmol/L significantly decreased the caspase-3 activity.CONCLUSIONL-carnosine at high level directly stimulates insulin secretion in NIT-1 cells, and L-carnosine at normal level promotes the cell proliferation and inhibits apoptosis induced by high concentration of glucose. Caspsase-3 and Bcl-2 may be partly involved in this process.

Carnosine; Glucose; Insulin; Apoptosis; NIT-1 cells

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.024