P-選擇素對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的作用*

郭四美， 亓翠玲， 葉 杰， 周 秦， 王麗京

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

1000-4718(2012)07-1197-05

2012-02-17

2012-05-17

科技部“973”項目國家重點基礎研究發(fā)展計劃(No. 2010CB529702);國家青年基金資助項目(No. 30900764)

△通訊作者 Tel：020-39352126；E-mail：wanglijing62@163.com

P-選擇素對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的作用*

郭四美， 亓翠玲， 葉 杰， 周 秦， 王麗京△

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

目的研究P-選擇素(P-selectin)在ApcMin/+小鼠腸道腫瘤中的作用。方法采用P-selectin基因缺失的基因工程小鼠和腸道腫瘤模型ApcMin/+小鼠雜交，計數(shù)ApcMin/+小鼠與ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠小腸及大腸腫瘤的數(shù)目，并測量其腫瘤體積，研究P-selectin對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的作用。結(jié)果與ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠在9周齡時腸道腫瘤數(shù)目與總負荷明顯減少。結(jié)論P-selectin缺失能夠顯著抑制ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的生長。

P-選擇素； 基因工程小鼠； 腸道腫瘤

P-選擇素(P-selectin)是黏附分子選擇素家族的重要成員,是一種相對分子質(zhì)量為14 kD膜糖蛋白，由胞外區(qū)的凝集素(lectin)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及補體調(diào)節(jié)蛋白 (complement regulatory protein，CRP) 重復序列, 以及跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成[1-3]。P-選擇素主要儲存在血小板的α顆粒和血管內(nèi)皮細胞的韋伯氏小體(Weibel-Palade body)中。它可以表達在活化的血小板和內(nèi)皮細胞表面，與中性粒細胞、單核細胞表面的P-選擇素配體相互作用[4]。因此，P-選擇素參與介導血小板活化或內(nèi)皮細胞與多形核白細胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)、單核細胞黏附,在炎癥、血栓形成中起著重要作用[5-8]。

P-選擇素在腫瘤中的作用尚存在爭議。P-選擇素可以在惡性腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細胞中表達，臨床研究表明P-選擇素與惡性腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移以及預后呈正相關[9]。可溶性P-選擇素在結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、何杰金病和非何杰金氏淋巴瘤病人中血漿水平與健康人相比明顯升高[10-14]，Schadendorf等[15]還報道,不同階段的黑色素瘤患者血清中可溶性P-選擇素均高于正常人，而且其水平與病情發(fā)展呈正相關。Kim等[16]給P-選擇素敲除小鼠(P-selectin-/-小鼠)皮下接種腫瘤細胞后發(fā)現(xiàn)P-選擇素缺失抑制了腫瘤的生長，但是具體的機制沒有表明。上述研究均表明P-選擇素促進了腫瘤的生長。

ApcMin/+小鼠是國際公認的研究腸道腫瘤的小鼠模型，具有可遺傳、自發(fā)和穩(wěn)定的特點，被廣泛應用于腸道腫瘤的研究工作，包括對腫瘤細胞生長、新生血管形成、凋亡、腫瘤免疫以及腫瘤治療藥物開發(fā)的研究[17-18]。為進一步分析該基因在致腫瘤方面的作用，進而研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制，更好地利用此模型研究P-選擇素對腫瘤的作用,我們構(gòu)建了ApcMin/+P-selectin-/-小鼠模型。并通過觀察ApcMin/+小鼠與ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠腸道腫瘤的數(shù)目、體積變化，研究P-選擇素在ApcMin/+小鼠模型自發(fā)腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物ApcMin/+(C57BL/6J-APCMin/J)小鼠和P-選擇素敲除(B6.129S7-Selptm1Bay/J,P-selectin-/-)小鼠由美國Jackson實驗室提供，C57小鼠購自廣東省動物中心。SPF環(huán)境中飼養(yǎng)擴群，室溫22～28 ℃，相對濕度50%～70%，自動光控(12 h明/12 h暗)。

1.2D儀器與試劑 獨立送回風凈化籠具購自蘇杭實驗動物設備廠,PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)，蛋白酶K及dNTP為Sigma產(chǎn)品，PCR引物由廣州英駿公司合成，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿為廣州康龍公司產(chǎn)品，溴化乙啶(EB)購于廣州康龍生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購于GE。

2方法

2.1建系及擴群 用ApcMin/+雄性和P-selectin-/-雌性成年小鼠以1∶3的比例雜交，其F1代中鑒定出突變型條帶ApcMin/+陽性小鼠即為ApcMin/+P-selectin+/-雜交小鼠，用此小鼠與P-selectin-/-小鼠雜交，得到F2代中鑒定出突變型條帶APCMin陽性和P-selectin-/-小鼠即為ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠。擴群用ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠與P-selectin-/-小鼠雜交即可。

2.2抽提小鼠DNA 小鼠剪尾1 cm于EP管中搗碎，加入500 μL DNA裂解液，10 μL蛋白酶K(20 g/L)，充分混勻，置55 ℃水浴鍋中過夜。次日拿出消化好的鼠尾，10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清。上清用等體積飽和酚，氯仿各250 μL抽提，10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清，重復1次。取上清加入800 μL無水乙醇沉淀，輕搖勻，有白色絮狀沉淀析出，即為DNA。10 000 r/min離心5 min，棄去上清。此時沉淀容易從黏附的管壁脫落，用移液器小心吸掉乙醇。自然無塵晾干后，用100 μL無菌去離子水溶解，4 ℃保存待PCR擴增、鑒定。

2.3ApcMin/+小鼠鑒定 按照Jakson實驗室的標準方法擴增DNA,ApcMin/+小鼠上游引物5'- GCC ATC CCT TCA CGT TAG -3'，下游引物5'-TTC CAC TTT GGC ATA AGG C-3'，5'-TTC TGA GAA AGA CAG AAG TTA-3'。反應條件為: 94 ℃變性2 min , 94 ℃ 30 s , 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.1 min,35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2.4P-selectin基因鑒定 按照Jakson實驗室的標準方法擴增DNA ,P-selectin基因上游引物5'-CTG AAT GAA CTG CAG GAC GA -3'，下游引物5'- ATA CTT TCT CGG CAG GAG CA -3'，5'-TTG TAA ATC AGA AGG AAG TGG -3'，5'- AGA GTT ACT CTT GAT GTA GAT CTCC-3'。反應條件為: 94 ℃變性3 min , 94 ℃ 20 s , 64 ℃ 30 s(每個循環(huán)減少0.5 ℃), 72 ℃ 35 s，12個循環(huán)；94 ℃ 20 s,58 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，25個循環(huán)；72 ℃ 2 min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2.5小鼠腸道腺瘤數(shù)目及體積的測定 選取ApcMin/+雜交小鼠與ApcMin/+P-selectin-/-小鼠(9周，不分雌雄)，每組6只。頸椎脫臼法處死后分離出整個腸道，區(qū)分小腸與結(jié)直腸。將小腸平均分為3段，PBS沖洗干凈后鋪直于濾紙上，沿著縱軸將腸道剪開，用裹有少許棉花的鑷子均勻?qū)⒛c組織鋪展開，和濾紙一起置于中性甲醛中固定過夜。固定后的組織用0.4%亞甲藍瞬時染色。體式解剖顯微鏡×20倍視野下，依次觀察拍照腸道中的每個腺瘤，用軟件中的測量工具測量每個腺瘤的最長徑及最短徑，計算腫瘤體積。計算公式為：體積=4πab2/3(a為長徑的一半，b為短徑的一半)。小腸腺瘤體積以半橢球來計算，大腸腺瘤以橢球來計算[19]。計數(shù)完畢后每段腸組織分別置于裝有70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6病理學研究 小鼠脫頸椎法處死，進行詳細尸體解剖檢查。10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，鏡檢。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1Min基因和P-selectin基因的鑒定

ApcMin/+小鼠和P-selectin-/-小鼠雜交，3代后，所得子代小鼠1、3、4號為ApcMin/+P-selectin-/-。ApcMin/+陽性小鼠有3條帶，分別為1 000 bp、600 bp和340 bp。P-selectin+/-有2條帶，一條帶為322 bp,另一條帶為172 bp;P-selectin-/-只有1條帶，為172 bp。圖1A為Min基因的鑒定圖，1、3和4號小鼠是Min基因陽性的小鼠。圖1B為P-selectin基因的鑒定圖， 1～5號小鼠為P-selectin敲除小鼠，6號為P-selectin+/-小鼠。

2腸道腫瘤分級

將腸道固定后亞甲藍染色，體式鏡下觀測。根據(jù)腫瘤位置和大小將其分級：小腸腺瘤小于2 mm×2 mm為小腸微腺瘤，見圖2A；大于2 mm×2 mm為小腸腺瘤，見圖2B；大腸上為大腸腫瘤，見圖2C。如圖2所示，小腸腫瘤多為息肉狀，而大腸腫瘤多為蒂狀腫瘤。

3ApcMin/+小鼠腸道腺瘤組織病理學特征

ApcMin/+小鼠腺瘤多發(fā)在小腸部位，顯微鏡下觀察ApcMin/+小腸的組織病理形態(tài)，可以分為3級：正常小腸絨毛(圖3A)，細胞排列整齊，腸道結(jié)構(gòu)分層清楚；小腸增生期(圖3B)腺管增生明顯，腺管細胞層數(shù)增多變厚；小腸腺瘤(圖3C)，多數(shù)為管狀絨毛狀腺瘤，較大的腺瘤其腺管呈現(xiàn)不規(guī)則分支、“背靠背”和共壁現(xiàn)象，瘤細胞明顯復層化，部分核上浮至腔緣，核極向消失，具有明顯異型性。

Figure 1. Identification ofApcMin/+andP-selectin-/-mice.A:PCR results ofMingene. 1:Min/+; 2: +/+; 3:Min/+; 4:Min/+; M:marker. B:PCR results ofP-selectingene. 1～5:P-selectin-/-; 6:P-selectin+/-; M: marker.

圖1ApcMin/+小鼠和P-selectin-/-小鼠鑒定

Figure 2. Tumor grading in the intestine ofApcMin/+mice (×2).A: small intestinal microadenoma; B: adenoma; C: colon tumor.

圖2ApcMin/+小鼠腸道腫瘤分級

Figure 3. Histopathological features of intestinal tissues inApcMin/+mice(HE staining, ×200).A: normal villus； B: hyperplasia； C: adenoma.

圖3ApcMin/+小鼠腸道組織病理學特征

4P-selectin缺失對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤數(shù)目的影響

取ApcMin/+與ApcMin/+P-selectin-/-小鼠腸道(9周，每組各6只)，體式顯微鏡下觀察并統(tǒng)計腸道腫瘤的數(shù)目。與ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠小腸上腺瘤數(shù)目明顯較少；ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠的小腸腺瘤、小腸腺瘤總數(shù)與腸道總腺瘤數(shù)目均比ApcMin/+小鼠少，腸道腺瘤減少了約61.19 %(P<0.01)，而2種小鼠大腸腫瘤數(shù)目差異不顯著(P>0.05)，見圖4。以上結(jié)果表明，P-selectin缺失能夠顯著性抑制ApcMin/+小鼠腸道腺瘤的形成。

5P-selectin缺失對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤體積的作用

對ApcMin/+與ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠腸道腫瘤體積進行統(tǒng)計。與ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠小腸上腺瘤體積明顯減少；ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠的小腸腺瘤體積、小腸腺瘤總體積與腸道總腺瘤體積均比ApcMin/+小鼠小，腸道腺瘤體積減少了約59.10 %(P<0.05)；而2種小鼠大腸腫瘤數(shù)目差異不顯著(P>0.05)，見圖5。結(jié)果表明，P-selectin缺失能夠顯著抑制ApcMin/+小鼠腸道腺瘤的體積生長。

討 論

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是結(jié)直腸癌發(fā)生的癌前病變，患者結(jié)直腸部位多發(fā)成百上千個腺瘤性息肉，抑癌基因結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,Apc)的突變是結(jié)直腸腫瘤的起始因素[20]。C57BL/6J-ApcMin/+小鼠品系由Dove實驗室1990年建立，在小鼠同源Apc基因第850位點發(fā)生無義突變，產(chǎn)生的截短APC蛋白導致Wnt信號通路紊亂,繼而導致腸道多發(fā)腺瘤，被認為是一種良好的FAP小鼠模型[21]。ApcMin/+小鼠整個生命周期內(nèi)的腸道腺瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律：9周時腺瘤形成，隨后小腸腺瘤數(shù)目不變，體積不斷增大，15周以后腺瘤快速生長，24周時可能由于腺瘤體積過大及其對營養(yǎng)的消耗而導致貧血從而使多數(shù)小鼠致死。20多年來C57BL/6J-ApcMin/J小鼠被廣泛應用于研究各種基因、藥物或飲食對結(jié)直腸癌的影響[19,23-24]，但是關于其腺瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律卻無文獻報道。

圖4P-selectin基因缺失減少ApcMin/+小鼠腸道腫瘤數(shù)目

圖5P-selectin基因缺失減少ApcMin/+小鼠腸道腫瘤體積

P-選擇素對腫瘤生長的作用還存在爭議，而且具體的分子機制還不清楚。在P-選擇素敲除小鼠體內(nèi)P-選擇素的功能完全缺失，因此可以利用此小鼠在體內(nèi)研究P-選擇素對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。

本研究用P-selectin敲除小鼠和自發(fā)性腸道腺瘤ApcMin/+小鼠雜交，建立P-selectin敲除背景下的自發(fā)腸道腺瘤小鼠(ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠)模型，可以認為是一種良好的用于研究早期結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的癌前病變動物模型。與前人研究中使用的裸鼠異體移植瘤模型相比，這種自發(fā)腫瘤的ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠模型更接近真實生理條件下腫瘤發(fā)生的過程。而且在這種自發(fā)腫瘤模型中，更接近自發(fā)腫瘤生長的病理過程。

本文通過同周齡比較ApcMin/+小鼠與ApcMin/+P-selectin-/-雜交小鼠腸道腫瘤的數(shù)目和體積，明確顯示，P-selectin的缺失能減少ApcMin/+小鼠腸道腺瘤易感性，P-selectin缺失在腸道腺瘤中起到重要的抑制作用。但由于ApcMin/+小鼠大腸上腫瘤數(shù)目較少，腫瘤多發(fā)于小腸，P-selectin基因缺失對大腸腫瘤的影響不明顯。基于在小鼠模型中的研究，P-selectin可能在人體腸道腫瘤中也同樣起重要的抑制作用，確切的結(jié)果有待在人體中進一步研究。

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RoleofP-selectininintestinaltumorigenesisinApcMin/+mice

GUO Si-mei, QI Cui-ling, YE Jie, ZHOU Qin, WANG Li-jing

(InstituteofVascularBiology,GuangdongPharmaceuticalCollege,Guangzhou510006,China.E-mail:wanglijing62@163.com)

AIM: To investigate the role of P-selectin in intestinal tumorigenesis inApcMin/+mice (C57BL/6J-ApcMin/J).METHODSFemaleP-selectinknockout mice (B6.129S7-Selptm1Bay/J, that wasP-selectin-/-) were mated with maleApcMin/+mice. The offspring was genotyped forMin+/-andP-selectinnull mutantions, which wereApcMin/+P-selectin-/-mice. The tumor number and gross tumor volume in the small and large intestines of theApcMin/+P-selectin-/-mice andApcMin/+mice were determined.RESULTSP-selectindeficiency inApcMin/+mice resulted in significant decreases in the tumor number and gross tumor volume in the small intestine and total intestine.CONCLUSIONDeletion ofP-selectinsignificantly inhibits the tumorigenesis in mouse intestines. In addition, the results also suggest that P-selectin may be a marker for colon cancer.

P-selectin; Genetically engineered mice; Intestinal neoplasms

R363.2；R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.009