銅綠假單胞菌與水解酶的關(guān)系

王 煒，陳曉萌，金 曄

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京100050）

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬中的代表菌種。最早是在1882年從病人化膿的傷口中分離出來，因產(chǎn)綠色色素，故俗稱綠膿桿菌。銅綠假單胞菌是革蘭染色陰性細(xì)菌，有鞭毛和莢膜，致病菌株有菌毛，一般不形成芽胞，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥、敗血癥、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染和囊性纖維化等疾病。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，在醫(yī)院感染中占有非常重要的地位。在美國，銅綠假單胞菌感染占醫(yī)院感染的10%，是肺囊性纖維化病人合并肺部感染的首要病原，是導(dǎo)致醫(yī)院獲得性肺炎的第2位病原，約17%的醫(yī)院獲得性肺炎為該細(xì)菌導(dǎo)致，同時(shí)該菌可引起11%左右的尿路感染，8%的手術(shù)部位感染，3%的血液感染［1］。本文探討水解酶的產(chǎn)生是否銅綠假單胞菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥表現(xiàn)的主要機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2010年5月－2011年5月，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心細(xì)菌室分離的來自不同患者的銅綠假單胞菌159株。經(jīng)VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）鑒定為銅綠假單胞菌。

質(zhì)量控制菌株：大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。為我實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 受試藥物

見表1。

表1 抗菌藥物來源、批號和效價(jià)

濃度梯度按照CLSI 2010版對敏感、中介、耐藥的解釋標(biāo)準(zhǔn)自行設(shè)計(jì)。

1.3 儀器及試劑

培養(yǎng)基：血瓊脂平板培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基（天津金章公司）

Mueller－Hinton（M－H）瓊脂為紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基（MH培養(yǎng)基干粉為英國Oxoid公司產(chǎn)品）

藥敏板：96孔藥敏板購自天津金章公司

生物安全柜（Thermo Scientifc 1300，美國）

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP－9162，上海）

比濁儀（生物梅里埃Vitek，法國）

微量移液器（eppendorf，德國）

1.4 方法

1.4.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測定以下抗菌藥物對試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度MIC，抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、舒巴坦／頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、他唑巴坦／哌拉西林、多粘菌素B。各藥物濃度為試驗(yàn)者自行設(shè)計(jì)、配制。所有MIC數(shù)據(jù)參照CLSI（Clinical And Laboratory Standards Institute，美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）2010版M100－S20文件解釋。

1.4.2 三維水解試驗(yàn)檢測β－內(nèi)酰胺酶 ①試劑的配制：克拉維酸溶液2 mmol／L，鄰氯西林溶液2 mmol／L，EDTA－Na2溶液（100 mmol／L）。②粗提酶的制備：將新分離的待檢菌密涂于1／4 MH瓊脂平板（Φ＝90 mm）上，35℃培養(yǎng)24 h后，用滅菌棉棒取下全部菌苔于1 ml滅菌生理鹽水中（用1.5 ml離心管）。將離心管置－70℃低溫冰箱凍融5次（凍2 h以上，再取出融化），在4℃條件下13 000 r／min離心1 h，抽取上清液，用0.2μm過濾器過濾，取1滴粗提酶液接種于 MH瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h后，以無菌生長為合格的粗提酶液。③酶型檢測：將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臉?biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC25922菌液涂抹于MH瓊脂平板上，10 min后于平板中央貼一片30μg IPM紙片，距紙片邊緣5 mm處垂直打4個(gè)1 mm寬10 mm長的槽，分別于槽內(nèi)加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）、粗提酶液（36μl）＋CLA（4μl）及粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）＋CLA（4μl）把含10μg／片亞胺培南（IPM）貼于 MH平板，分別在距亞胺培南紙片邊緣5 mm處，挖2個(gè)1×10 mm的槽，分別于槽內(nèi)加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋EDTA－Na2（4μl），置35℃培養(yǎng)24 h。④酶型判斷：當(dāng)抑菌環(huán)出現(xiàn)缺損，形成一指向藥敏紙片的矢狀菌苔，即酶水解實(shí)驗(yàn)呈陰性。加入酶抑制劑時(shí)，CLA單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽性，即該菌ESBL檢測陽性。CLO單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽性，即該菌AmpC酶檢測陽性。CLO或CLA單獨(dú)加入不能抑制酶活性（抑酶試驗(yàn)陰性），同時(shí)加入CLO和CLA時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽性，說明該菌同時(shí)產(chǎn)生Amp C和ESBLs兩種酶。當(dāng)同時(shí)加入CLO和CLA時(shí)抑酶試驗(yàn)仍為陰性，該菌可能產(chǎn)生耐抑制劑廣譜酶；若EDTA單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)陽性，即該菌金屬β內(nèi)酰胺酶（MBL）陽性。見圖1。

2 結(jié)果

圖1 三維水解試驗(yàn)檢測β－內(nèi)酰胺酶陰性

表2 159株碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌對抗菌藥物的藥敏結(jié)果

159株臨床分離的非重復(fù)銅綠假單胞菌，單藥MIC顯示試驗(yàn)中銅綠假單胞菌對于CLSI2010推薦和臨床常用抗菌藥物（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內(nèi)酰胺類／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）敏感率低，呈現(xiàn)多重耐藥表型，見表2。多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA）的納入標(biāo)準(zhǔn)為：抗菌藥物耐藥種類大于5類（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內(nèi)酰胺類／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）；尤其是對于頭孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦耐藥性為100%，對于頭孢吡肟、氟喹諾酮類、氨基糖苷類大約半數(shù)細(xì)菌呈現(xiàn)耐藥，對于多粘菌素B細(xì)菌全部呈現(xiàn)敏感。推測出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是臨床對于β－內(nèi)酰胺／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑的使用偏好，經(jīng)驗(yàn)用藥使用此類藥物比例較大，容易出現(xiàn)耐藥情況。多粘菌素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)外漏，為慢效殺菌劑。很少通過消化道吸收，主要通過腎臟排出，故腎功能不全者應(yīng)減少劑量。多粘菌素類不良反應(yīng)明顯，主要為腎毒性和神經(jīng)毒性，但多粘菌素的抗菌作用強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性，故當(dāng)各種革蘭陰性桿菌對其他抗菌藥物耐藥或療效不佳時(shí)，仍可作為選用藥物。臨床可供選用的是多粘菌素B和多粘菌素E。多粘菌素E在腎、肝、肺等組織中濃度比多粘菌素B高，但不易通過無炎癥的血腦屏障［2－4］。

表3 159株銅綠假單胞菌對7類抗生素的耐藥情況

水解酶驗(yàn)證：通過三維實(shí)驗(yàn)159株P(guān)a中檢測出產(chǎn)MBL15株，Amp C酶13株；說明水解酶的產(chǎn)生不是本院多重耐藥銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。

3 討論

銅綠假單胞菌主要是在抗菌藥物的選擇壓力下耐藥率不斷上升，其耐藥機(jī)制比較復(fù)雜：可通過產(chǎn)生金屬β－內(nèi)酰胺酶水解碳青霉烯類抗菌藥物；可通過Opr D2蛋白特異性通道表達(dá)減少或缺失減少亞胺培南的進(jìn)入；通過群體性生物被膜的形成減少抗菌藥物的攝入；對已經(jīng)進(jìn)入的抗菌藥物還可通過主動(dòng)外排系統(tǒng)泵出。但對不同碳青霉烯耐藥機(jī)制有所差異，亞胺培南耐藥主要涉及外膜蛋白缺失；美羅培南耐藥則需細(xì)菌主動(dòng)外排表達(dá)增加；金屬酶及生物被膜的產(chǎn)生可能導(dǎo)致細(xì)菌對所有碳青霉烯類耐藥。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，這四種機(jī)制可單獨(dú)發(fā)揮作用，也可聯(lián)合發(fā)揮作用，但是也有研究證明外排泵在生物被膜耐藥中無作用［5－7］，現(xiàn)在還不斷有新的耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)只在細(xì)菌的表型方面檢測了159株銅綠假單胞菌是否產(chǎn)生金屬酶或者頭孢菌素酶，未進(jìn)一步檢測其它水解酶，下一步實(shí)驗(yàn)要進(jìn)一步完善。對于以上的耐藥機(jī)制我們還應(yīng)進(jìn)行更深入的研究，指導(dǎo)臨床合理用藥，并積極開發(fā)新的抗菌藥物來針對這些耐藥機(jī)制。同時(shí)因?yàn)檫@些耐藥機(jī)制都是在抗菌藥物（尤其是第三代頭孢菌素）的選擇壓力下產(chǎn)生或加強(qiáng)的，我們要倡導(dǎo)合理、適量、分階梯的使用抗菌藥物，并對當(dāng)?shù)刂匾幬镞M(jìn)行周期性耐藥監(jiān)測，提倡個(gè)性化選擇藥物，針對不同的臨床藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用不同的抗菌藥物，尤其是在治療過程中耐藥性的演變。減緩銅綠假單胞菌耐藥的產(chǎn)生和發(fā)展，最大限度的減少多重耐藥的銅綠假單胞菌出現(xiàn)，從而保障人民群眾的生命健康。

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