自組裝法仿生骨材料的制備及性能分析

徐 寧，陳玉云，許國華，葉曉健

在臨床工作中越來越多的外傷、脊柱和關節(jié)疾病、骨腫瘤以及先天性的畸形的患者需要手術植骨治療，尋找一種與天然骨相似的骨替代材料已經(jīng)成為了生物材料研究的熱點之一。天然骨組織主要由2 大部分構成，有機成分約占1/3 和無機成分約占2/3，其中有機成分的90%是膠原，無機成分則主要是羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和少量的碳酸磷灰石、氟磷灰石等［1］。從結構上來說，天然骨組織是一種具有復雜而精細分級結構的有機和無機復合體，膠原分子與羥基磷灰石呈納米級的層狀排列［2］。骨組織的組成成分和結構是相互獨立但又有關聯(lián)的2 個方面，共同決定了骨的性能。骨組織的成分基本固定，而不同的微觀結構對骨的性能有很大影響，因此合成出在微結構上與天然骨組織接近的生物材料對于骨材料性能的提升具有重要意義。Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen)作為一種天然提取蛋白，其具有生物相容性，生物可降解性，力學性能，對細胞的粘附、擴增、分化作用良好等優(yōu)勢，近幾年逐漸應用于生物替代材料和組織工程材料。

納米羥基磷灰石/Ⅰ型膠原(HA/COL)復合物在組成成分上與天然骨基質相似，對HA/COL 結構進行調控從而可以使其具有高度的仿生性，有望從根本上克服傳統(tǒng)材料的缺陷［3］。本研究采用自組裝的方法合成出HA/COL 復合物，研究表明其結構與天然骨的層片狀結構極為相似。通過對HA/COL復合物性能進行研究，為其在臨床的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

可溶性醫(yī)用Ⅰ型膠原，CaCl2，NaH2PO4，NaOH均購自國藥集團化學試劑有限公司(上海)，并且均為分析純。α-MEM 培養(yǎng)基由Gibco 公司提供。

1.2 實驗方法

將1.8 g 膠原溶解于3 000mL 去離子水中，在室溫條件下充分溶解5 h，配制成0.6 mg/mL 的膠原溶液。取420 mL 濃度為0.1 mol/L 的CaCl2溶液加入配制好的膠原溶液中，在室溫下置于磁力攪拌器上混合 20 min。緩慢加入 NaH2PO4溶液(252 mL，0.1 mol/L)同時用0.1 mol/L 的NaOH 調節(jié)pH 值，pH 值為7 時出現(xiàn)白色懸濁液，維持這時的飽和溶液的pH 值在7.0 持續(xù)24 h(室溫)。用離心機(5 000 r/min，5 min)離心飽和溶液，去除上清液，反復用去離子化水洗滌以去除鹽離子。把制備出的樣品在－80℃冰箱冷凍24 h 后取出，冷凍干燥24 h，制得HA/COL 復合材料白色粉末。

1.3 表征手段

X 射線粉末衍射儀(D/max-2600/pc，RIGAKU，日本)分析HA/COL 的晶體結構，CuKα，4°/min 步長;透射電鏡TEM(JEM-2100F，Joel，日本)對HA 以及HA/COL 的微觀形態(tài)進行觀察;傅里葉紅外光譜儀(Nicolet 6700，Thermo Fisher Scientific，美國)對HA、HA/COL 進行紅外光譜測試，吸收波數(shù)范圍4 000 cm-1～400 cm-1;熱重分析TG(STAPT 1 600，LINSEIS，德國)測試HA/COL 燒結質量，測試溫度范圍是室溫～800℃。

1.4 復合材料的細胞學毒性檢測

采用四唑鹽比色法(MTT 法)進行復合材料的細胞學毒性評價。把小鼠MC3T3-E1 細胞鋪在96 孔板上，每孔大約1×105個細胞，加入新鮮α-MEM 培養(yǎng)基每孔100 μL，放入細胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)24 h;取HA/COL 復合材料200 mg 加入2 mL培養(yǎng)基中浸泡(200 mg/mL)24 h 后離心(3 000 r/min，10 min)取浸提液。將浸提液逐步梯度稀釋，濃度分別為100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL。除去96 孔板上的培養(yǎng)基，依次加入上述濃度浸提液，每個濃度重復6 孔。放入恒溫培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMS0每孔100 μL，10～15 min后用酶標儀在492 nm 波長下測光密度(optical density，OD)值。

細胞相對增殖率(R)的計算公式:

R=OD492樣/OD492陰

式中:OD492樣為樣品的OD492;OD492陰為未加樣品空白對照的OD492

根據(jù)不同時期各組R 值采用5 分制法進行細胞毒性分級評價［4］，見表1。當R≥80%，說明樣品對細胞的增殖無毒害作用，反之對細胞的增殖有毒害作用。

表1 美國藥典中細胞相對增殖率(R)與細胞毒性分級關系Tab.1 Relationship of cell proliferation rate(R)and cell toxicity grade in American pharmacopeia

1.5 小鼠MC3T3-E1 細胞在復合材料表面的生長情況觀察

將HA/COL 復合物至于無水乙醇中，在超聲振蕩機中使其均勻分散，采用靜電噴涂法將HA/COL復合物均勻噴涂于鈦片表面(直徑10 mm，厚度5 mm)作為實驗組。同樣方法處理羥基磷灰石粉末作為對照組。將鈦片滅菌后置于16 孔板中，每孔加入濃度為1×105/mL 的MC3T3-E1 細胞懸液1mL，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，于1 d、3 d、7 d后掃描電鏡觀察細胞在材料表面生長情況。

2 結 果

2.1 復合材料的晶粒尺寸和微觀結構

圖1 為HA 與HA/COL 復合物的透視電鏡圖片。圖a，b 示HA 晶粒形狀為棒狀，晶粒尺寸長度＜100 nm，寬度為(35±4)nm。圖c，d 示HA/COL 晶粒形狀為針狀，長度為(130±10)nm，寬度為(10±2)nm。該結果說明COL 的加入明顯調控了HA 晶粒的形貌和尺寸，晶粒由棒狀變?yōu)獒槧?，長度增長，寬度變窄，長徑比明顯增大。圖a 中HA 晶粒呈無序、隨機、雜亂分布;圖d 中HA 晶粒密集交錯并呈現(xiàn)層片狀的有序分布;上述現(xiàn)象說明HA 以COL 為基質，在COL 中有序排布［5］，COL 明顯影響HA 晶粒在基質中的排布次序。

2.2 復合材料的物相和結晶度分析

圖1 HA 和HA/COL 透視電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscope images of HA and HA/COL

圖2 是HA，HA/COL 及天然骨的X 線粉末衍射圖譜。由圖可見，3 種樣品的衍射圖譜在衍射峰位置上基本一致，加入COL 后并未出現(xiàn)其他晶相的衍射峰，所有衍射峰都歸屬于HA晶相;HA/COL樣品中(002)晶面的衍射峰強度明顯高于另外2 個樣品，(202)晶面的衍射峰峰型增寬，接近于天然骨(202)晶面的衍射峰峰型;上述現(xiàn)象說明COL 具有誘導HA 在(002)晶面擇優(yōu)取向的作用，HA/COL 的結構更加接近于天然骨。

圖2 HA，HA/COL 及天然骨的X 線粉末衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction patterns of HA，HA/COL with natural bone

2.3 復合材料的紅外光譜分析

圖3 是HA，HA/COL，COL 及天然骨的對比傅里葉變換紅外光譜學圖譜。HA 曲線中3 420 cm-1和1 033 cm-1、957 cm-1、分別對應的是HA 的特征基團OH-和PO43-的吸收峰;COL 曲線中1 624 cm-1，1 514 cm-1，1 234 cm-1分別為蛋白酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的吸收峰。這些特征峰也都出現(xiàn)在了HA/COL 樣品中，并且沒有其他新的特征峰，說明COL 與HA 發(fā)生吸附。相對比于COL 樣品，HA/COL 樣品中的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基團向高波數(shù)位移，基本上酰胺Ⅰ的吸收峰從1 624 cm-1移動到1 632 cm-1左右，酰胺Ⅱ的吸收峰從1 514 cm-1移動到1 528 cm-1左右，酰胺Ⅲ的吸收峰從1 234 cm-1移動到1 240 cm-1左右，特征吸收峰發(fā)生挪移說明了HA/COL 中HA 與COL 分子鏈之間產(chǎn)生了化學鍵合。

圖3 HA，HA/COL，COL 及天然骨的傅里葉變換紅外光譜學圖譜Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy of of HA，HA/COL，COL and natural bone

2.4 復合材料的細胞學毒性評價

利用MTT 法評價不同濃度的HA 及HA/COl 浸提液對小鼠MC3T3-E1 細胞活性的影響(見圖4)。培養(yǎng)24 h 后，HA 和HA/COL 2組樣品的細胞相對增殖率(R)都＞80%，這說明樣品對細胞增殖無毒害作用。同時，浸提液濃度對細胞活性的有直接影響:隨著浸提液濃度降低，其細胞相對增殖率升高;反之逐步降低。當浸提液濃度＜50 mg/mL 時，HA/COL 的細胞相對增殖率均＞100%，表現(xiàn)為0 級毒性。

圖4 不同濃度的樣品經(jīng)過24 h 共培養(yǎng)后對細胞存活率的影響Fig.4 Cell viability after cultured with diffident concentrations of samples for 24 h

2.5 細胞在復合材料表面的生長情況

圖5 為小鼠MC3T3-E1 細胞在復合材料表面生長情況。如圖所示，實驗組材料表面的粗糙度明顯大于對照組，7 d 后實驗組和對照組細胞數(shù)量均有所增加。培養(yǎng)1 d 后可見實驗組細胞數(shù)量明顯大于對照組，說明HA/COL 復合物對于細胞的粘附起到顯著作用。在細胞生長的過程中，實驗組合對照組的細胞形態(tài)基本一致，說明HA/COL 復合物不會改變細胞形態(tài)。

3 討 論

理想的骨替代材料不僅要求在組成成分上與自然骨相似，而且在微觀結構上也應該接近于自然骨，并具有良好的理化性能及生物相容性［6-7］。HA/COL 復合物相對于有機和金屬體內(nèi)置入材料來說，具有良好的生物活性和生物相容性［8-9］，置入體內(nèi)安全無毒，并且具有良好的可降解性、骨誘導性和傳導性［10］。本實驗通過控制一定的工藝過程，采用自組裝法，制備出微觀結構與自然骨相似的層片狀HA/COL 復合物，達到了在組成成分與組成結構上雙重仿生的目的。

圖5 細胞在復合材料表面生長情況掃描電鏡圖片(×300)Fig.5 Scanning electron microscopy images of cell growing on HA/COL surface(×300)

通過對HA/COL 復合物的理化特性進行分析可以看出，COL 的加入使HA 晶粒的形狀由原來的棒狀變?yōu)獒槧?，長度增長，寬度變窄，長徑比明顯增大，而晶粒尺寸仍在納米尺度范圍內(nèi);HA 晶粒呈現(xiàn)出密集交錯的層片狀分布。上述現(xiàn)象是由于在礦化組織中規(guī)整的結構都是源于生物大分子的規(guī)整的自組裝，COL 作為模板控制HA 的結晶、生長、尺寸和形貌。HA/COL 復合物的X 線粉末衍射圖譜分析可見膠原的加入并未改變HA 的晶相，同時使得(002)晶面的衍射峰更加接近于自然骨的衍射峰，說明COL 具有誘導HA 在(002)晶面擇優(yōu)取向的作用，并使HA/COL 復合物在物相上更加接近于自然骨。最后對HA/COL 復合物進行了傅里葉變換紅外光譜學圖譜分析，可以看出在HA/COL 復合物樣品中出現(xiàn)了HA 的特征基團OH-和PO43-的吸收峰以及蛋白酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的吸收峰，并且蛋白酰胺的3 個吸收峰都發(fā)生了向高波位的紅移現(xiàn)象，說明COL 與HA 發(fā)生了吸附并產(chǎn)生了分子鏈之間的化學鍵合而不是單純的物理混合。

采用MTT 法對HA/COL 復合物的細胞毒性進行測試，可以看出當復合物浸提液濃度＜50 mg/mL時，細胞增值率均＞100%，細胞毒性表現(xiàn)為0 級毒性。但當浸提液濃度為100 mg/mL 時，細胞增值率＞80%，表現(xiàn)為1 級毒性，同時實驗組的細胞增殖率均小于對照組。以上現(xiàn)象可能是由于自組裝法在制備復合物過程中的分離提純不夠完全，以及所購買的膠原蛋白摻有雜質。但盡管如此，復合物的細胞毒性表現(xiàn)為0-1 級，符合ISO10993(GB/T16886)標準。從小鼠MC3T3-E1 細胞在材料表面的生長情況可以看出，復合物對細胞有明顯的增強粘附作用，并且不改變細胞形態(tài)，說明復合物對細胞無毒害作用，與細胞毒性實驗的結果相吻合。

綜上所述，采用自組裝法合成的HA/COL 復合物微觀結構與自然骨相似，COL 與HA 之間產(chǎn)生了化學鍵合，晶粒尺度在納米范圍內(nèi)，無細胞毒性，細胞在其表面生長狀態(tài)良好。是一種良好的人工骨支架材料。

［1］Beck JS，Vartuli JC，Roth WJ，et al.A new family of mesoporous molecular sieves prepared with liquid crystal template［J］.J Am Chen Soc，1992，114(27):10834-10843.

［2］Glimcher MJ.Role of collagen and phosphoproteins in the calcification of bone and other collagenous tissues［M］.Rubin R，Weiss GB，Putney JW.Calcium in Biological Systems.New York:Plenum Press，1985:607.

［3］Iijima M，Moriwaki Y，Kuboki Y.Oriented and lengthwise growth of octacalcium phosphate on collagenous matrix in vitro［J］.Connect Tissue Res，1997，36(1):51-61.

［4］Zhu S，Zhou K，Huang B，et al.Hydroxyapatite nanoparticles:a novel material of gene carrier［J］.Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi，2005，2(5):980-984.

［5］Yao JM，Wei KM，Li L，et al.Effect of initial bombyx mori silk fibroin structure on the protein biomineralization［J］.Huaxue xuebao，2007，65(7):635-639.

［6］Mawatari T，Miura H，Kawano T，et al.Bone quantity and quality to its mechanical integrity［J］.Clin Calcium，2004，14(4):555-560.

［7］Mori S.Contribution of bone quality to fracture risk［J］.Clin Calcium，2004，14(10):33-38.

［8］Charrière E，Terrazzoni S，Pittet C，et al.Mechanical characterization of brushite and hydroxyapatite cements［J］.Biomaterials，2001，22(21):2937-2945.

［9］Xu HH，Takagi S，Sun L，et al.Development of a nonrigid，durable calcium phosphate cement for use in periodontal bone repair［J］.J Am Dent Assoc，2006，137(8):1131-1138.

［10］劉勇，裴國獻，江汕，等.新型多孔β-磷酸三鈣作為骨組織工程支架材料的評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(23):4563-4567.