靈發(fā)素（LFS）對誘導半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中一些生化指標的影響

梁瓊月 何 冰 周鳳玨 解云英 陳汝賢 許鴻章 許鴻源▲

1.廣西大學農學院，廣西南寧 530004；2.中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100089

靈發(fā)素（LFS）對誘導半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中一些生化指標的影響

梁瓊月1何 冰1周鳳玨1解云英2陳汝賢2許鴻章2許鴻源1▲

1.廣西大學農學院，廣西南寧 530004；2.中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100089

目的 探索LFS高效優(yōu)質誘導半夏體細胞胚胎發(fā)生的機制。方法 以半夏無菌苗葉柄切段作外植體，MS為基本培養(yǎng)基，比較MS+BA2，0+NAA0.1（CK）和MS+LFS 0.3在誘導體細胞胚胎發(fā)生和發(fā)育過程中一些生化指標的變化差異。結果 （1）LFS顯著提高體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中可溶性蛋白質、可溶性糖和淀粉等的含量，為增殖更多更壯的體胚提供物質保障。（2）LFS還顯著提高SOD、POD和PPO三種抗氧化酶的活性，以利及時清除旺盛代謝產生的自由基，為體細胞胚胎的發(fā)生發(fā)育創(chuàng)造良好的內環(huán)境。結論 LFS能高效優(yōu)質地誘導半夏體胚的發(fā)生發(fā)育，與其顯著提高可溶性蛋白質、可溶性糖和淀粉的含量及提高抗氧化酶的活性密切相關。

半夏；靈發(fā)素；體細胞胚胎

半夏Pinellia ternata（Thunb） Briet為天南星科多年生草本植物，是重要的傳統(tǒng)中藥材和出口物資，地下塊莖炮制后入藥，能燥濕化痰、降逆止嘔，消痞散結，生藥用外治癰腫[1]。因市場需求不斷增加，野生資源匱乏，對其組培快繁技術的研究便應運而生。但是，按照傳統(tǒng)技術路線，生產程序復雜，繁殖效率不高。許鴻源等[2-4]利用LFS（Lingfasu，靈發(fā)素，代號PGR-08，亦稱狹霉素）同時具有細胞分裂素（Cytokinin，CTK）和生長素（Auxin）兩大類植物激素生物活性的特點，建立了簡單高效生產半夏體細胞胚胎（Somatic embryo.亦稱胚狀體，embryoid）和組培苗的技術[5]。本文報道LFS高效率誘導半夏體細胞胚胎發(fā)生及發(fā)育的生物化學基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料

LFS為實驗室自備重結晶品，純度≥98%。半夏，經廣西藥用植物園鐘仕強主任中藥師鑒定為Pinellia ternata（Thunb）Briet。按參考文獻[5]的方法，用其球莖獲得無菌苗后，在超凈工作臺上切取2 cm左右的葉柄切段為外植體材料，備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制及外植體培養(yǎng)條件 根據許鴻源[5]優(yōu)選出的LFS適宜濃度，以MS為基本培養(yǎng)基，配制MS+LFS 0.3 mg/L（單位下同），并根據張愛民[6]和薛建平[7]的研究結果，配制常規(guī)誘導半夏體胚的培養(yǎng)基MS+BA2，0+NAA0.1（CK），以便做直接對比研究。兩種培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂4.5 g/L，調pH 5.8～6.0，常規(guī)滅菌，備用。培養(yǎng)條件：溫度，晝/夜28/22℃（±2℃），光照1500 lx，11 h/d。共進行3批培養(yǎng)，每批接種50瓶，每瓶5個葉柄切段。

1.2.2 取樣 在培養(yǎng)期間，根據外植體脫分化與再分化的不同階段，分別采取外植體、胚性愈傷組織、早期胚和成熟胚，各適量，分別進行相關生化指標的測定。

1.2.3 生化指標測定 可溶性蛋白質含量用考馬斯亮藍法[8]測定；可溶性糖含量用蒽酮法[9]測定；淀粉含量用蒽酮法[9]測定；SOD（超氧化物歧化酶）活性用NBT光氧化還原法[10]測定；POD（過氧化物酶）活性用愈創(chuàng)木酚法[10]測定；PPO（多酚氧化酶）活性用鄰苯二酚法[11]測定。

2 結果與分析

2.1 LFS對可溶性蛋白質含量的影響

由圖1可見，無論是LFS組，還是CK組，在外植體階段可溶性蛋白質含量都最低；胚性愈傷組織階段可溶性蛋白質含量達最大值，幾乎增加一倍多；到早期胚階段有明顯下降，但仍高于外植體階段。而到成熟胚及幼苗階段則又有一定的上升。這說明，外植體在脫分化形成胚性愈傷組織時，合成并累積了大量蛋白質，為進一步再分化出新的器官奠定物質基礎。隨著新器官（體細胞胚胎）的發(fā)生與成長，直至新個體的建成，蛋白質的合成及其向其他物質的轉化會更趨復雜。但是在體細胞胚胎發(fā)育的整個過程中，LFS都使蛋白質維持在比CK組更高的水平。從而證明，LFS確實增加了培養(yǎng)物的蛋白質合成代謝與累積。這對高效率獲得更多體細胞胚胎有重要意義。

圖1 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)育過程中可溶性蛋白質含量的影響（柱狀圖上不同字母表示差異顯著，P＜0.05，下同）

2.2 LFS對可溶性糖含量的影響

圖2顯示，在整個培養(yǎng)過程中，LFS組可溶性糖含量一直高于CK組。特別是在胚性愈傷組織形成階段，兩個實驗組可溶性糖的含量都急劇上升至最大值，為新器官的建成準備充足的碳源與能源，以迎接新物質合成和新器官建成高潮的到來。在此階段，LFS則使可溶性糖含量高出CK組54.6%，達極顯著水平。

圖2 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中可溶性糖含量的影響

2.3 LFS對淀粉含量的影響

圖3顯示，在胚性愈傷組織形成階段，淀粉含量達最大值，隨著體胚的建成和發(fā)育，與可溶性糖一樣，淀粉含量也呈下降趨勢。可是LFS組一直高于CK組，只是差異未達顯著水平。然而在成熟胚階段，LFS組則顯著高于CK組。LFS促使成熟胚貯藏更多的淀粉，無疑是提高其質量的標志之一。結合上述，LFS促進淀粉、可溶性糖及可溶性蛋白質的大量合成和累積，可能是其能誘導外植體形成更多、更壯體細胞胚胎的內在原因之一，這些都是建成新器官的重要物質基礎。只是在體細胞胚胎的成熟過程中，淀粉和可溶性糖等碳水化合物，作為推動整體代謝的能量來源和其他眾多次生化合物的碳架來源，消耗得更快更多（圖2，3），而蛋白質含量則相對穩(wěn)定（圖1）。

圖3 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中淀粉含量的影響

2.4 LFS對SOD活性的影響

圖4顯示，CK組與LFS組，由外植體直到早期體胚形成，SOD活性都逐漸升高，之后隨著體胚的成熟和萌發(fā)成苗，SOD活性又逐漸下降。在整個過程中，除幼苗階段外，LFS組SOD活性均顯著高于CK組。尤其是胚性愈傷組織階段和早期胚階段LFS組SOD活性分別高出CK組40.0%和49.4%。無疑，這對于在脫分化與再分化過程中，旺盛代謝所產生的過量超氧自由基的及時歧化非常有利，從而保證體細胞胚胎的健康發(fā)育，漸少夭折。

圖4 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中SOD活性的影響

2.5 LFS對POD活性的影響

圖5顯示，在體胚的發(fā)生和發(fā)育過程中，POD的活性高峰到早期胚階段才出現(xiàn)，比SOD的高峰要晚一步。這可能是SOD把大量超氧化物自由基歧化為H2O2（過氧化氫，雙氧水）之后，才刺激POD活性迅速提高的緣故。無論如何，LFS組從早期胚到成熟胚，再到幼苗，POD活性都顯著高于CK組，尤其是早期胚階段竟高出56.4%。這對于把SOD產生的大量對機體仍然非常有害的H2O2及時轉化為安全的H2O，以保證體細胞胚胎健康地發(fā)育和萌發(fā)成苗極其重要。

2.6 LFS對PPO活性的影響

圖6顯示，在體胚的發(fā)生和發(fā)育過程中，PPO活性變化與POD基本一致，高峰的出現(xiàn)也比SOD晚，這也可用“底物效應”來解釋，有了一定量多酚自由基的累積之后，PPO活性才迅速升高。多酚自由基被轉化以后，PPO活性又急劇下降。在體胚早期，LFS組PPO活性顯著高于CK組，高出80%以上?？紤]到SOD，POD和PPO都是機體超氧自由基防御體系中最重要的成員，所以LFS對它們活性的顯著影響，具有重要的理論意義和實用價值。

圖5 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中POD活性的影響

圖6 LFS對半夏體細胞胚胎發(fā)生過程中PPO活性的影響

3 討論

植物的體細胞胚胎是獲得植物再生植株（組培苗）和人工種子，進行植物種群快速繁殖的重要材料。因此，如何高效優(yōu)質地生產體細胞胚胎，已成近年來植物生物學研究的熱門領域[12-13]。但是，此前所用的常規(guī)技術，都是以BA，NAA，2,4-D，等數種生長調節(jié)劑復配成多種類、多因素的誘導培養(yǎng)基，經過多個技術環(huán)節(jié)，才能獲得體細胞胚胎，不僅生產程序復雜，而且效率不高。而LFS作為一種微生物源的新型植物生長調節(jié)劑，既具有CTK的生物活性，又具有Auxin的生物活性，因此在植物體細胞胚胎的生產中往往表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。近年來，用LFS配制的單一培養(yǎng)基，不但相繼直接成功地誘導了名貴中藥材三七[14-15]、半夏[5]及甘蔗[16]等植物體細胞胚胎的發(fā)生及發(fā)育，而且實現(xiàn)了高效優(yōu)質。本研究以半夏為材料證明，LFS之所以比傳統(tǒng)的BA和NAA等常用生長調節(jié)劑組合能更高效率地誘導體細胞胚胎發(fā)生和發(fā)育，是因為它顯著地增加了可溶性蛋白質、可溶性糖和淀粉等構成機體的基本物質，為體胚的發(fā)生和發(fā)育提供了更強大的物質保障。同時LFS還能顯著提高SOD，POD和PPO等抗氧化酶的活性，有利及時清除自由基，為體胚健康地發(fā)生和發(fā)育提供良好的內環(huán)境。

本研究證明，LFS單獨誘導半夏體細胞胚胎發(fā)生和發(fā)育與BA和NAA等組合共同誘導相比，在整個過程中，可溶性蛋白質、可溶性糖及淀粉等的含量變化及抗氧化酶的活性變化之總體趨勢非常相似。而且，其他研究者[17-19]在其他不同植物上，用不同調節(jié)劑的誘導組合，研究結果也都得到類似的趨勢。這說明，盡管植物體細胞胚胎的發(fā)生和發(fā)育是一個極其復雜的過程，是一系列受基因調控并按順序表達的結果，但是只要相關基因控制程序被啟動，可溶性蛋白質等新器官建成所必需的物質合成及相關酶的活性，就會隨之增加。這與啟動相關基因控制程序的外源誘導因子之化學本質似乎無關。甚至，外源誘導因子可以是由不同化合物組成的多元體，也可以是單一化合物的單元體。因此，在誘導體細胞胚胎發(fā)生時，對外源誘導因子的選擇是一項重要而復雜的工作。

4 小結

LFS能高效優(yōu)質地誘導體細胞胚胎發(fā)生和發(fā)育，是因為它顯著地增加了可溶性蛋白質、可溶性糖和淀粉等構成機體的基本物質，為體胚的發(fā)生和發(fā)育提供了更強大的物質保障。同時，還顯著提高SOD，POD和PPO等抗氧化酶的活性，有利于及時清除自由基，為體胚健康地發(fā)生和發(fā)育提供良好的內環(huán)境。

[1] 中國醫(yī)科學院藥物研究所．中藥志（第2冊）[M]．第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：38-42.

[2] 許鴻源.狹霉素在植物學和農學上的應用[J].中華人民共和國知識產權局發(fā)明專利公報，2003，19（34）：6.

[3] 許鴻源，許鴻章，楊美純，等.PGR-08理化性質及生物活性的研究[J]．廣西植物，2003，23（5）：461-463.

[4] Xu Hong-Yuan，Xu Hong-Zhang，He Bing，et al.Lingfasu and Its Use on Plant Tissue Cuture in Vitro[M]//Zhihong Xu. “Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond”.Beijing：Springer，2007：97-101.

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[6] 張愛民，楊生玉，薛建平，等．多種因素對半夏外植體直接誘導形成試管小塊莖的影響[J]．中國中藥雜志，2005，30（8）：576-579.

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[8] 鄒琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業(yè)出版社，2000：129-130.

[9] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2001：214-217.

許鴻源，男，1941 年4 月生。1964 年北京農業(yè)大學（現(xiàn)中國農業(yè)大學）植物生理學和生物化學專業(yè)畢業(yè)。1967 年西北農學院（現(xiàn)西北農林科技大學）植物生物化學研究生畢業(yè)。現(xiàn)為廣西大學農學院教授，研究生導師，兼任中國植物生理學會第七、八、九屆理事和廣西植物生理學會理事長。長期從事植物生理學和生物化學方面的教學與科學研究。主持完成國內和國際合作課題近20 項；完成全國高等農業(yè)院校教材《植物生理學》的部分編寫工作；在國內外發(fā)表學術論文70 余篇；已獲得國家發(fā)明專利證書5 項。

Effects of LFS on some biochemical indicators during inducing somatic embryogenesis of Pinellia Ternata(Thunb) Briet

LIANG Qiongyue1HE Bing1ZHOU Fengjue1XIE Yunying2CHEN Ruxian2XU Hongzhang2XU Hongyuan1
1.Agricultural College of Guangxi University,Nanning 530005,China;2.Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100050,China

ObjectiveTo explore the mechanism of inducing somatic embryogenesis with high efficiency and quality by LFS.MethodsTaken petiole cuttings of aseptic plantlets as explants.MS as the basic medium and contrast the difference of some biochemical indexes in process of somatic embryogenesis and development induced by MS+BA2,0+NAA0.1(CK) and MS+LFS 0.3.Results(1)LFS significantly improved the content of soluble protein，soluble sugar and starch during somatic embryogenesis and development. (2) LFS also significantly improved the activity of SOD,POD and PPO.ConclusionThere are close relationship between LFS induced the Somatic embryos occurrence and development with high efficiency and quality and it significantly increase the content of soluble protein,soluble sugar and starch.It also improve the activities of antioxidant enzymes.

Pinellia ternata Briet;Lingfasu(LFS);Somatic embryo

S-3

A

2095-0616（2012）11-09-03

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2012ZX09301002-001-018）；國家”863”專項經費（2006AA10A213）資助。

▲通訊作者

（部分參考文獻略，如有需要者請與作者聯(lián)系）

2012-05-25）