基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測(cè)定川味香腸中的蘇丹紅染料

楊春林，李佳峻，胡 強(qiáng)，吳 蔚，蒙 輝，彭燈水

（1.樂(lè)山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所食品化工中心，四川樂(lè)山 614000；2.上海海豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，上海202179；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川雅安 625014）

基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測(cè)定川味香腸中的蘇丹紅染料

楊春林1，李佳峻1，胡 強(qiáng)1，吳 蔚1，蒙 輝2，彭燈水3

（1.樂(lè)山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所食品化工中心，四川樂(lè)山 614000；2.上海海豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，上海202179；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川雅安 625014）

建立了川味香腸中蘇丹紅I～I(xiàn)V的基質(zhì)固相分散（MSPD）-高效液相色譜（HPLC）分析方法。樣品以無(wú)水硫酸鈉作為分散基體，研磨均勻后與中性氧化鋁同時(shí)裝柱，正己烷淋洗凈化，以丙酮-正己烷（5∶95，V/V）溶液洗脫。用Inertsil ODS-sp C18柱（4.6mm×250mm，5μm）進(jìn)行分離，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的甲醇，流動(dòng)相B為0.02mol/L的乙酸銨溶液（A∶B= 85∶15，V/V），等度洗脫，柱溫40℃。二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，利用保留時(shí)間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量。4種蘇丹紅染料在0.10～50.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，蘇丹紅I、II、III、IV的檢出限（LOD）分別為0.008～0.011mg/kg（信噪比S/N=3）。在添加濃度為5.0～25.0mg/kg范圍內(nèi)平均回收率達(dá)85.54%～94.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.87%～4.23%（n=6）。

川味香腸，蘇丹紅I～I(xiàn)V，高效液相色譜，基質(zhì)固相分散

蘇丹紅（Sudan Dyes）屬于偶氮類(lèi)化工染色劑，主要用于為溶劑、油、蠟、汽油增色以及鞋、地板等的增光以及生化毒理學(xué)研究中的著色等[1-3]。據(jù)英國(guó)聯(lián)邦危險(xiǎn)品管理局測(cè)試，長(zhǎng)期低量攝入蘇丹紅可能致癌[4]。研究表明，蘇丹紅本身不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生有害的影響，但它可以被還原降解為對(duì)人體具有強(qiáng)烈的致癌作用的芳香胺類(lèi)化合物[5]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將蘇丹紅歸為三類(lèi)致癌物，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都明令禁止將其作為色素添加劑在食品和飼料中使用[6]。由于蘇丹紅顏色鮮艷、不易褪色并具有油溶性的特點(diǎn)，不法分子使用含蘇丹紅的辣椒作為川味香腸的調(diào)味料或直接用蘇丹紅代替紅曲紅天然色素給香腸上色，以降低生產(chǎn)成本，獲得高額利潤(rùn)。所以建立有效的檢測(cè)川味香腸中蘇丹紅的方法具有重要的意義。目前，食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、氣質(zhì)聯(lián)用法[13]、分光光度法[14]、熒光光譜法[15]、共振光散射法[16]以及酶聯(lián)免疫檢測(cè)法等[17]，常用的前處理技術(shù)主要包括溶劑萃取法（SE）、固相萃取法（SPE）、固相微萃取技術(shù)（SPME）等。我國(guó)頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法[18]采用正己烷提取，中性氧化鋁柱凈化，該方法對(duì)辣椒面等含油脂和水分較少的樣品提取和凈化效果較好，回收率和靈敏度很高。基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）[19]集合了傳統(tǒng)的樣品均質(zhì)、提取、過(guò)濾、凈化等過(guò)程，使樣品的前處理簡(jiǎn)便快捷，減少有機(jī)溶劑的使用量，大大提高傳統(tǒng)提取方法不易分散的樣品的回收率，該技術(shù)已廣泛用于動(dòng)物組織和水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留的分析[20]。川味香腸含油脂和動(dòng)物蛋白較多，不易分散，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法來(lái)提取川味香腸中的蘇丹紅，用高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，并優(yōu)化前處理技術(shù)和色譜條件，建立川味香腸中蘇丹紅I～I(xiàn)V的基質(zhì)固相分散—高效液相色譜測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；乙醚、甲酸、乙酸銨、無(wú)水硫酸鈉（500℃烘烤3h） 成都市科龍化工試劑廠；層析用中性氧化鋁（100～200目） 上海陸都化學(xué)試劑廠。

高效液相色譜儀LC-20A（配置四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、光電二極管陣列檢測(cè)器） 日本SHIMADZU公司；氮吹儀N-EVAP 美國(guó)Organomation公司；電子天平DV215CD（精確至0.00001g） 美國(guó)Ohaus公司；純水機(jī) 四川沃特爾科技有限公司；超聲波清洗器 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-sp C18（4.6mm× 250mm，5μm）；流動(dòng)相：含0.1%甲酸的甲醇+0.02mol/L的乙酸銨溶液（85∶15，V/V），使用前過(guò)0.45μm濾膜；柱溫：40℃，流速：1.0m L/m in，等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。

1.2.2 中性氧化鋁制備 稱(chēng)取在200℃下烘烤2h的中性氧化鋁100g，加入1.8m L水，混勻后密封備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取蘇丹紅I、II、III、IV標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確至0.01mg），用乙醚溶解并用丙酮稀釋成濃度為1mg/m L的儲(chǔ)備液。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用丙酮稀釋定容成濃度為0.10、0.50、1.25、5.00、10.00、25.00、 50.00μg/m L的工作溶液，取20μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作曲線。

1.2.4 樣品處理及測(cè)定 取有代表性的川味香腸切細(xì)后勻漿，準(zhǔn)確稱(chēng)取5g試樣于100m L研缽中，加入5g無(wú)水硫酸鈉，研磨均勻備用。取20cm×2cm玻璃層析柱，在其底部墊一層薄薄的脫脂棉，以干法裝入制備好的中性氧化鋁至約3cm高，輕輕敲擊使填實(shí)后用10m L正己烷預(yù)淋洗；加入研磨好的均勻樣品，輕輕敲實(shí)后于上部塞一層薄薄的脫脂棉，架于鐵架臺(tái)上。用20～30m L正己烷淋洗至無(wú)色，棄淋洗液，用50m L含5%丙酮的正己烷洗脫，收集洗脫液于塑料離心管中，氮吹儀濃縮至近干，用丙酮準(zhǔn)確定容至5m L，0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相色譜分析，以保留時(shí)間結(jié)合光譜圖定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將蘇丹紅I～I(xiàn)V號(hào)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行色譜分離并用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)200～550nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，光譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，在該方法儀器條件下四種蘇丹紅染料均在480～520nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收，其中蘇丹紅I和蘇丹紅II的最大吸收波長(zhǎng)小于500nm，分別為476nm和495nm，蘇丹紅III和蘇丹紅IV的最大吸收波長(zhǎng)大于500nm，為506nm和516nm。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T19681－2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法—高效液相色譜法》）采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為500nm，在該波長(zhǎng)條件下，蘇丹紅I～I(xiàn)V號(hào)均有較高的響應(yīng)值，但是川味香腸實(shí)際樣品的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，在500nm波長(zhǎng)下蘇丹紅III和蘇丹紅IV色譜峰之間的干擾較多，通過(guò)篩選驗(yàn)證，選擇490nm為蘇丹紅I～I(xiàn)V號(hào)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 蘇丹紅I～I(xiàn)V紫外可見(jiàn)掃描光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra of Sudan I～I(xiàn)V

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中，采用溶劑A：0.1%甲酸的水溶液∶乙腈=85∶15，溶劑B：0.1%甲酸的乙腈溶液∶丙酮=80∶20作為流動(dòng)相，梯度洗脫。該方法大量使用乙腈、丙酮等高毒試劑，危害操作人員的身體健康，對(duì)環(huán)境很不友好。并且由于該方法采用梯度洗脫，在第10min有機(jī)相從75%改變至100%，為了平衡基線以進(jìn)行下一個(gè)樣品的分析，第32m in開(kāi)始有機(jī)相又從100%變換到75%，所以分析過(guò)程的后半段基線的波動(dòng)較大（圖2A），對(duì)蘇丹紅III特別是蘇丹紅IV的準(zhǔn)確定量造成一定的困難，并且從一個(gè)樣品開(kāi)始分析到下一個(gè)樣品進(jìn)樣需要50m in甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-硫酸銨水溶液和甲醇-硫酸銨水溶液作為流動(dòng)相做等度洗脫，均不能將四種蘇丹紅完全分離；用酸性甲醇-水溶液能將目標(biāo)物質(zhì)分離，但是蘇丹紅IV色譜峰拖尾嚴(yán)重，在水溶液中加入0.02mmol/L的乙酸銨等度洗脫不但分離完全，并且峰型尖銳對(duì)稱(chēng)（圖2B）。本方法采用等度洗脫將4種蘇丹紅完全分離，與國(guó)標(biāo)方法相比四個(gè)目標(biāo)物的出峰時(shí)間稍有提前，并且由于基線平穩(wěn)，進(jìn)樣后25m in即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的分析，大大縮短分析時(shí)間，提高工作效率，定量更加準(zhǔn)確。

圖2 蘇丹紅I～I(xiàn)V標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard solution of Sudan I～I(xiàn)V

2.3 樣品前處理優(yōu)化及測(cè)定

2.3.1 基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法 香腸中含有大量的油脂和動(dòng)物蛋白，而蘇丹紅又是油溶性的物質(zhì)，在提取過(guò)程中由于樣品中一部分動(dòng)物蛋白變性后與油脂一起作用，將蘇丹紅包裹起來(lái)，用有機(jī)溶劑直接提取不能有效分散樣品，提取率較低。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法用正己烷從香腸中提取蘇丹紅，濃縮后過(guò)中性氧化鋁柱，由于大量油脂的集中過(guò)柱，影響中性氧化鋁對(duì)蘇丹紅的吸附，加標(biāo)回收率很低，其中蘇丹紅III的平均加標(biāo)回收率只有40%左右。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)肉制品的特點(diǎn)，采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法，用無(wú)水硫酸鈉與樣品一起研磨后再與中性氧化鋁一起裝柱，達(dá)到分散樣品的目的，使提取溶劑與樣品充分接觸。由于樣品沒(méi)有濃縮，油脂分散進(jìn)入氧化鋁柱，對(duì)氧化鋁活性影響較?。患尤霟o(wú)水硫酸鈉還可以消除香腸中水分對(duì)氧化鋁吸附活性的影響，提高樣品回收率。

自制的層析柱的分離效果受多方面因素的影響，對(duì)操作技術(shù)的要求較高，在裝填層析柱時(shí)應(yīng)輕輕敲擊管柱，使層析柱中的填充物裝填結(jié)實(shí)，不能有縫隙，否則在層析的過(guò)程中會(huì)因淋洗液的作用形成斷層或氣泡，嚴(yán)重影響層析效果；在淋洗的過(guò)程中，應(yīng)盡量使淋洗液順著層析柱的管壁緩緩注入，避免破壞層析柱表面層的平整，使層析過(guò)程均勻連續(xù)，保證層析的效果。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液及樣品定容溶劑的選擇 在高效液相色譜（HPLC）分析中，樣品的極性和進(jìn)樣的體積對(duì)色譜峰的峰型和保留時(shí)間有一定的影響。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法用正己烷定容標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，但是在樣品的處理過(guò)程中采用丙酮定容后進(jìn)行液相色譜分析，由于溶劑的不統(tǒng)一，導(dǎo)致樣品目標(biāo)峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰保留時(shí)間有差異；在本方法的儀器條件下，進(jìn)樣量20μL，加標(biāo)樣品中蘇丹紅II和蘇丹紅III的保留時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間推遲1min以上（圖3A、B）；在主要以保留時(shí)間定性的HPLC分析中，這種差異是致命的。考慮與流動(dòng)相的互溶以保證結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，本方法對(duì)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液均采用丙酮定容，所得目標(biāo)峰的峰型尖銳對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間重現(xiàn)性好（圖3C、D），定性準(zhǔn)確。由圖3還可以看出，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法處理的樣品非常干凈，對(duì)目標(biāo)峰無(wú)干擾，完全滿(mǎn)足HPLC分析的要求。

圖3 兩種方法標(biāo)準(zhǔn)溶液與加標(biāo)樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard solution and spiked samples of the twomethods

2.3.3 氧化鋁的活性及洗脫體積的確定 由于中性氧化鋁對(duì)蘇丹紅的吸附活性是由含水量的多少?zèng)Q定的，一般先對(duì)中性氧化鋁進(jìn)行烘烤脫水活化，再加入一定量的水使其失活來(lái)控制中性氧化鋁的活性。以含5%丙酮的正己烷50m L為洗脫液，測(cè)定不同含水條件下中性氧化鋁凈化加標(biāo)樣品的回收率。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)100g中性氧化鋁中含水量低于1.5m L時(shí)，氧化鋁活性太高，蘇丹紅I和蘇丹紅III不能完全洗脫，回收率較低；當(dāng)100g中性氧化鋁中含水量高于2.5m L時(shí)，氧化鋁活性太低，對(duì)蘇丹紅的吸附力不夠，用正己烷淋洗時(shí)部分蘇丹紅II和蘇丹紅IV就被洗脫下來(lái)，在收集的20m L淋洗液中測(cè)得蘇丹紅II和蘇丹紅IV約為加標(biāo)量的40%～50%。經(jīng)過(guò)多次調(diào)整和測(cè)定，最后確定在100g活化的中性氧化鋁中加入1.8m L，所得的4種蘇丹紅回收率都較高。在此基礎(chǔ)上，采用含5%丙酮的正己烷對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每5m L洗脫液收集一次，當(dāng)收集的洗脫液總量在50m L以后，洗脫液中不含蘇丹紅，故洗脫液體積確定為50m L。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

以質(zhì)量濃度-峰面積做校正曲線，得到線性回歸方程，4種蘇丹紅染料在0.10～50.00μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性方程見(jiàn)表1。以3倍信噪比為檢出限（LOD），計(jì)算得出蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的檢出限分別為0.008～0.011mg/kg。以10倍信噪比為定量限（LOQ），計(jì)算出蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ定量限分別為0.025～0.033mg/kg。

表1 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1 Standard curves，limitof detection，and limit of quantification for SudanⅠ～Ⅳ

2.5 方法的回收率和精密度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)川味香腸中蘇丹紅染料進(jìn)行3個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)6次。由表2可見(jiàn)，4種蘇丹紅染料在添加濃度為5.0～25.0mg/kg范圍內(nèi)平均回收率為85.54%～94.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～4.23%，完全滿(mǎn)足食品分析的要求。其中，蘇丹紅Ⅰ的回收率最高，在5.0mg/kg的低濃度添加水平下平均回收率仍可達(dá)90.54%。蘇丹紅Ⅳ的平均回收率相對(duì)較低，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差稍大，這是因?yàn)樘K丹紅Ⅳ的色譜峰峰型較寬，靈敏度偏低，特別是物質(zhì)含量很低的情況下，在定量上不夠精確。

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)市區(qū)的大中型超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的川味香腸進(jìn)行抽檢，分別按照上述方法進(jìn)行處理，通過(guò)保留時(shí)間和光譜圖定性，未發(fā)現(xiàn)蘇丹紅陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

建立了川味香腸中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的高效液相色譜分析方法。實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)固相分散—氧化鋁層析法對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，利用光譜圖和保留時(shí)間雙重定性增加了方法的可靠性。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，減少了超聲提取、過(guò)柱前的濃縮等操作步驟；由于簡(jiǎn)化了流動(dòng)相并采用等度洗脫方式，基線平穩(wěn)，所以定量更加準(zhǔn)確，在縮短分析時(shí)間的同時(shí)減少有毒試劑的使用和排放。此方法簡(jiǎn)便、快速、可靠，重現(xiàn)性好，可用于川味香腸中蘇丹紅染料含量的測(cè)定。

表2 蘇丹紅在川味香腸中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of Sudan in Sichuan sausage（n=6）

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Determ ination of Sudan dyes in Sichuan sausage by combination of matrix solid-phase dispersion and high performance liquid chromatography

YANG Chun-lin1，LI Jia-jun1，HU Qiang1，WUW ei1，MENG Hui2，PENG Deng-shui3
（1.Center of Food and Chemical Product，Leshan Quality Supervising&Inspection Bureau，Leshan 614000，China；2.Shanghai Haifeng Modern Agricultural Co.，Ltd.，Shanghai202179，China；3.College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

A high-performance liquid chromatog raphy（HPLC）method combined w ith matrix solid-phase d ispersion（MSPD）was estab lished for determ ination of Sudan I～I(xiàn)V in Sichuan sausage.The sam p le was m ixed with anhyd rous sod ium sulfate to be a part of the chromatography column.The samp les were c leaned up w ith hexane and rinsed w ith 50m L of acetone-hexane（5∶95，V/V）.Separation was carried out on reversedphase InertsilODS-sp C18column（4.6mm×250mm，5μm）by using am ixture ofmethanoland form ic acid（999∶1）as mobile phase A，and 0.02mol/L ammonium acetate solution as mobile phase B（A∶B=85∶15，V/V）at a flow rate of 1.0m L/m in.Detec ted at the wavelength of 490nm by d iode array detector as the temperature was hold at 40℃.The retention time and spectra charac terization were both used to determ ine Sudan dyes and the content of Sudan dyes was quantified by external standard method.Sudan I～I(xiàn)V have good linearity in the range of 0.10～50.00μg/m L，the correlation coefficients were all above 0.9999 and the detection lim its of four Sudan dyes were 0.008～0.011mg/kg（S/N=3）.With the add ition of 5.0 to 25.0mg/kg of Sudan standard to sam p les，the average recovery rates of four Sudan dyes in Sichuan sausage were between 85.54%and 94.66%.The relative standard deviations（RSDs）of sp iked sam p les varied from 0.87%to 4.23%（n=6）.

Sichuan sausage；Sudan I～I(xiàn)V；high-performance liquid chromatog raphy；matrix solid-phase d ispersion

TS251.7

A

1002-0306（2012）09-0380-05

2011－08－11

楊春林（1982－），男，碩士，工程師，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制。