果糖月桂酸單酯的分離純化及鑒定

付 敏，趙強忠，仇超穎，劉 寧，趙謀明

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640）

果糖月桂酸單酯的分離純化及鑒定

付 敏，趙強忠，仇超穎，劉 寧，趙謀明*

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640）

采用硅膠柱層析色譜對叔戊醇中固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖月桂酸單酯進行分離純化。確定了薄層層析（TLC）條件，并通過反相-高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（RP-HPLC-ELSD）測定柱層析純化產(chǎn)物的純度。利用液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）、紅外光譜（FT-IR）和13C核磁共振（13CNMR）對目標產(chǎn)物進行確認，鑒定目標產(chǎn)物為酯化位點在1位和6位的果糖月桂酸單酯，四種異構(gòu)體如下：1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯和6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯，且1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯的比例最高。

果糖月桂酸單酯，固定化磷脂酶Lecitase?Ultra，薄層層析，硅膠柱層析，結(jié)構(gòu)

高級脂肪酸糖酯具有兩親結(jié)構(gòu)，是一類重要的非離子表面活性劑，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)，具有無毒、無臭、無刺激、易生物降解等優(yōu)點[1]。糖酯的合成方法有化學法和酶法：相對化學法的生產(chǎn)能耗高且產(chǎn)品的酯化位置和酯化度不易控制，酶法合成則具有高效性和特異選擇性、反應條件溫和、副產(chǎn)物較少等特點。在酶催化合成糖酯的研究中，簡捷、方便的分析方法是優(yōu)化合成工藝，提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。常用糖酯分離純化的方法如下：TLC是最常用的方法[2]，可以方便快速地對待測物質(zhì)進行定性定量測定；硅膠柱層析色譜分離法，操作簡單，是大量制備純品的良好選擇，常用的洗脫劑為氯仿、甲醇、乙酸乙酯等[3]；氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[4]需要對糖酯衍生化，由于衍生化過程較復雜，因此限制了其應用；高效液相色譜（HPLC）[5]，分離效果好，測定靈敏度高，但此法分離成本較高，且分離量小，難以大量制備樣品。磷脂酶Lecitase?Ultra（E.C.3.1.1.32）是Novozymes公司推出的一種微生物來源的磷脂酶，同時具有較高的脂肪酶活性和磷脂酶活性[6]，價格是同類脂肪酶的10%～15%。因此，本實驗以叔戊醇為溶劑，利用固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成果糖月桂酸單酯，采用硅膠柱層析梯度洗脫對其進行分離純化，并對純化產(chǎn)物進行鑒定。本研究可為分離鑒定果糖月桂酸單酯提供比較系統(tǒng)的理論平臺，為其進一步的生產(chǎn)和研究提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶Lecitase?Ultra 丹麥諾維信公司；大孔吸附樹脂 天津海光化工有限公司；D-果糖 上海伯奧生物科技有限公司；月桂酸 天津市大茂化學試劑廠；硅膠板G 青島普科分離材料有限公司；柱層析硅膠 80～100目，青島海洋化工廠分廠；4?分子篩 天津市福辰化學試劑廠；叔戊醇（AR級） 上海阿拉丁公司；甲醇，氯仿等 均為分析純。

754分光光度計 上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；S20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；DZF-6000真空干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司；3300（ELSD 3300）蒸發(fā)光散射檢測器 美國A lltech公司；Esquire HCT PLUS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Vector 33傅里葉變換紅外譜儀、AVANCE Digital 400MHz超導核磁共振譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化[7]室溫下，以大孔吸附樹脂DA-201為載體，對磷脂酶Lecitase?Ultra進行吸附法固定化：以pH=7.0，0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液為媒介，加酶量30mg/g樹脂，吸附時間4h；真空干燥后，備用。

1.2.2 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成果糖月桂酸單酯 250m L具塞玻璃瓶中加入2g果糖，7g月桂酸和80m L脫水叔戊醇，置于恒溫振蕩器中預平衡1h后加入5g 4?分子篩，1.3g固定化磷脂酶，43℃下，160r/m in反應72h。

1.2.3 反應液TLC分析 取酶促反應液點于薄板的底端，在選用的展開劑中上行展開。顯色劑為lg脲溶于4.5m L 85%磷酸和48m L水飽和的正丁醇混合溶液[8]，將揮干的硅膠板浸漬于顯色劑中2m in，自然晾干，105℃烘5m in，斑點為藍色。

1.2.4 產(chǎn)物硅膠柱層析分離 將反應液過濾去除分子篩和酶（回收），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，將固體微熱溶于氯仿∶甲醇=2∶1（v∶v），再通過硅膠層析柱分離制備。取濃縮液5m L上硅膠層析柱（硅膠80～100目，柱30× 500mm），收集洗出液，并用TLC監(jiān)測，合并斑點相同的組分。

1.2.5 產(chǎn)物純度分析 將收集到的目標組分通過RP-HPLC-ELSD進行純度測定，按峰面積歸一化法計算產(chǎn)物純度。

色譜柱XBridge C18（5μm，4.6×150mm），流動相為甲醇/水=90∶10（v∶v）[9]，流速為0.5m L/m in，柱溫20℃，進樣量10μL，ELSD漂移管溫度40℃，載氣流速1.5L/m in。

1.2.6 產(chǎn)物HPLC-ESI-MS分析[10]稱取5mg收集到的目標組分溶于5m L色譜純甲醇中，取5μL進行分析。

色譜條件：色譜柱XBridge C18（5μm，4.6×150mm）；流動相為甲醇/水=80∶20（v∶v），流速0.6m L/min；檢測波長210nm，柱溫25℃。

質(zhì)譜條件（MS）：電噴霧（ESI）離子源，正離子模式，毛細管電壓為188V，錐孔電壓為40V，質(zhì)荷比的范圍m/z為100～600。

1.2.7 產(chǎn)物FT-IR分析 分離純化的產(chǎn)物用FT-IR通過KBr壓片法測定其結(jié)構(gòu)，取約200mg KBr置于瑪瑙缽中研碎，紅外燈干燥，加5mg左右的樣品，研勻、壓片，在400～4000cm-1范圍內(nèi)掃描，掃描8次，分辨率4cm-1，得到純化產(chǎn)物的紅外吸收光譜。

1.2.8 產(chǎn)物13C NMR分析 稱取收集到的目標組分100mg，以四甲基硅烷為內(nèi)標，采用超導核磁共振譜儀，以氘代甲醇為溶劑[11]，30℃，采用400MHz掃描，碳譜的脈沖寬度為12.75μs，脈沖功率為3.0dB，共振頻率為100.62MHz，循環(huán)延遲2s，掃描1000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應液TLC分析

影響TLC對混合物進行分離效果的三個主要因素分別為：被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性和展開劑的極性。在本實驗中被分離物質(zhì)的極性和硅膠的活性是恒定的，因此主要通過改變展開劑的極性提高分離效果。

表1 展開劑組成對合成果糖月桂酸單酯的反應液分離效果的影響Table 1 Effectofmobile phase composition on separation of monolauroyl fructose

2.2 產(chǎn)物硅膠柱層析分離

硅膠吸附色譜分離一組極性不同的混合物時，可以通過調(diào)節(jié)洗脫劑的極性來達到較好的分離效果。果糖為強極性化合物，月桂酸為弱極性化合物，反應生成的果糖月桂酸單酯為中等極性化合物，鑒于極性的差異，可將產(chǎn)物進行有效地分離。Gulten Sekeroglu[12]利用硅膠柱層析對合成的糖酯進行純化，獲得良好的分離效果。

在本實驗中，為分離純化和大量制備果糖月桂酸單酯，將優(yōu)化的TLC分離條件應用于硅膠柱層析，即選用氯仿∶甲醇作為流動相，再通過對流動相比例、洗脫方式、洗脫速度、進樣量各因素進行優(yōu)化，得出最佳色譜條件：依次采用100%氯仿、氯仿∶甲醇= 93∶7（v∶v）、氯仿∶甲醇=90∶10（v∶v）進行梯度洗脫，1.2m L/min，上樣量為25g/g硅膠。產(chǎn)物獲得良好的分離效果，結(jié)果如圖1所示，隨著洗脫溶劑極性的增大，月桂酸、果糖月桂酸單酯和果糖依次洗脫下來。

圖1 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖單酯的硅膠柱層析Fig.1 Silica gel column chromatography ofmonolauroyl fructose catalyzed by immobilized Lecitase?Ultra

2.3 產(chǎn)物純度分析

對硅膠柱層析分離純化的目標產(chǎn)物果糖月桂酸單酯進行純度檢測。在酯類化合物的研究中大多采用反相HPLC對產(chǎn)物進行分析，常用的紫外檢測器（UV）和示差檢測器（RID）用于糖酯分析時并不理想，使用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），可以取得較好的效果[13]。因此本實驗采用RP-HPLC-ELSD對硅膠柱層析純化后產(chǎn)物進行純度分析。圖2即為硅膠柱層析純化后的果糖月桂酸單酯HPLC分析圖譜，在實驗條件下，果糖月桂酸單酯的保留時間為5.402m in。由圖2中得知純化后的果糖月桂酸單酯得到單一色譜峰，根據(jù)面積歸一化法，果糖月桂酸單酯的純度大于99%[14]。因此硅膠柱層析能夠很好地分離固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖酯產(chǎn)物，可用于純化產(chǎn)物。

圖2 硅膠柱層析純化的果糖單酯HPLC-ELSD圖譜Fig.2 HPLC chromatographic analysis ofmonolauroyl fructose purified by Silica gel column chromatography

2.4 產(chǎn)物HPLC-ESI-MS分析

液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合了液相色譜對微量樣品測量的靈敏性和質(zhì)譜對物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的測定的準確性，因此是一種有效的分析物質(zhì)的方法。ESI離子源適用于電離極性大且非揮發(fā)性的大分子物質(zhì)，如天然的表面活性劑對其有較好的響應，且具有極低的檢測極限。脂肪酸糖酯是一類非離子表面活性劑，因此運用HPLC-ESI-MS對脂肪酸糖酯進行鑒定具有良好的操作性和高靈敏性。朱金麗等[15]已利用ESI-MS對長鏈脂肪酸蔗糖酯進行結(jié)構(gòu)鑒定。

本實驗通過對上述硅膠柱層析分離純化的果糖月桂酸單酯進行HPLC-ESI-MS分析，結(jié)果如圖3所示。譜圖中出現(xiàn)[M+Na]、[M-H2O+Na]和[M+2H2O+K]質(zhì)譜信號峰分別為385.3、367.3、437.3，所對應的M值和果糖月桂酸單酯的分子量362相符合，由此得知，硅膠柱層析分離純化的果糖酯為果糖月桂酸單酯。

圖3 果糖月桂酸單酯HPLC-ESI-MS圖譜Fig.3 HPLC-MS chromatographic analysis of monolauroyl fructose

2.5 產(chǎn)物FT-IR分析

圖4 果糖月桂酸單酯的FT-IR圖譜Fig.4 FT-IR spectrum ofmonolauroyl fructose

FT-IR光譜提供了化合物中特定官能團的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)紅外吸收光譜圖中特征吸收峰的位置、數(shù)目、相對強度和形狀等參數(shù)可判斷樣品中存在哪些基團，進而對產(chǎn)品進行歸類分析。果糖脂肪酸單酯的特征官能團為羥基和酯基。由圖4可以看出，3388cm-1寬而鈍的峰為締合的-OH的伸縮振動吸收，1736cm-1的強峰為-C=O的伸縮振動吸收峰，是酯的特征吸收峰。同時從2923、1464cm-1的較強吸收和1379cm-1的較弱吸收可以看出樣品-CH2多而-CH3少；在1700cm-1處沒有明顯的吸收峰，故可判斷分離組分不含月桂酸。綜上可知，經(jīng)硅膠柱層析分離純化的果糖酯為果糖月桂酸單酯。

2.6 產(chǎn)物13C NMR分析

在叔戊醇中，呋喃型果糖和吡喃型果糖同時存在。兩種形式的果糖分別存在兩種差向異構(gòu)體，即α型和β型，因此D-果糖在叔戊醇中存在有4種構(gòu)象，分別是β-D-吡喃果糖、α-D-吡喃果糖、β-D-呋喃果糖和α-D-呋喃果糖。圖5即為固定化磷脂酶Lecitase?Ultra在脫水叔戊醇中催化果糖與月桂酸的酯化產(chǎn)物。由于吡喃型的六元環(huán)和β構(gòu)型是優(yōu)勢構(gòu)象，因此四種構(gòu)象中以β-D-吡喃果糖占的比例最大，在參與酯化的過程中，其優(yōu)勢構(gòu)象參與反應的機率更大[16]。

本實驗對純化后的果糖月桂酸單酯進行13C NMR分析，并結(jié)合HPLC-MS和FT-IR分析結(jié)果，如圖6所示，判定產(chǎn)物中共有4種組分[11，17]，分別為：（Ⅰ）1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯（l-lauroyl-β-D-fructopyranose）、（Ⅱ）1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯（1-lauroyl-α-D-fructopyranose）、（Ⅲ）1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯（1-lauroyl-β-D-fructofuranose）、（Ⅳ）6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯（6-lauroyl-β-D-fructofuranose）。從圖譜的信號強度可知，四種組分的比例為3∶2∶1.1∶1（Ⅰ∶Ⅳ∶Ⅱ∶Ⅲ），由此可見，?；x擇性地發(fā)生在果糖分子的1位和6位羥基上，并主要以1位羥基為主，與β-D-吡喃果糖為優(yōu)勢構(gòu)象相符。表2為果糖月桂酸單酯的13C NMR的化學位移數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 確定了TLC分析條件：展開劑為氯仿/甲醇/乙酸/水（81∶9∶8∶2，v∶v∶v∶v）；顯色劑為lg脲溶于4.5m L 85%磷酸和48m L水飽和的正丁醇混合溶液，結(jié)果得到果糖月桂酸單酯的Rf值為0.54。

圖5 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖與月桂酸酯化產(chǎn)物Fig.5 Reaction products of the enzymaticmonoacylations of fructose catalyzed by immobilized Lecitase?Ultra

圖6 果糖月桂酸單酯在果糖區(qū)域段13C-NMR圖譜Fig.6 13C-NMR spectrum in the sugar region of monolauroyl fructose

3.2 采用硅膠柱層析對固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖月桂酸單酯進行分離純化，最佳色譜條件：依次采用100%氯仿、氯仿∶甲醇=93∶7（v∶v）、氯仿∶甲醇=90∶10（v∶v）進行梯度洗脫，1.2m L/m in，上樣量為25g/g硅膠。TLC監(jiān)測并收集洗出液，通過RPHPLC-ELSD鑒定目標產(chǎn)物純度大于99%。

3.3 對柱層析純化樣品進行系統(tǒng)的分析鑒定，分別采用HPLC-ESI-MS、FT-IR、13C NMR手段鑒定了目標產(chǎn)物為果糖月桂酸單酯，并確定四種單酯異構(gòu)體：1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯和6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯，其中1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯的比例最高。

表2 不同果糖月桂酸單酯同分異構(gòu)體的13CNMR的化學位移數(shù)據(jù)（δ，ppm）Table 2 13C chemical shifts in CD3OD for the various fructose lauric isomers（δ，ppm）

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Purification and identification ofmonolauroyl fructose

FU M in，ZHAO Qiang-zhong，QIU Chao-ying，LIU Ning，ZHAO M ou-m ing*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

A novel enzymatic-catalyzing p rocess of monolauroyl fructose was developed.In the p rocess immobilized Lecitase?Ultra was used as biocatalyst in anhyd rous 2-methyl-2-butanol.Silica gel column chromatog raphy was used to separate and purify the fructose ester.The qualitative analysis condition of TLC was confirmed and the purity was identified by RP-HPLC-ELSD.Structure was verified by HPLC-ESI-MS，F(xiàn)TIR，13C NMR.As a result，a m ixture of the C-1 and C-6 monoacylated frutose esters，four isomers ofmonolauroyl fructose were obtained：l-lauroyl-β-D-fructopyranose，1-lauroyl-α-D-fructopyranose，1-lauroyl-β-D-fructofuranose，6-lauroyl-β-D-fructofuranose，and l-lauroyl-β-D-fructopyranose was the highest p roportion.

monolauroyl fructose；immobilized Lecitase?Ultra；TLC；silica gel column chromatography；structure

TS202.3

B

1002-0306（2012）22-0276-05

2012－05－17 *通訊聯(lián)系人

付敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

粵港招標項目（2009A020700003）；國家863計劃項目（2010AA101505）。