分光光度法測定仙鶴草總酚含量的方法研究

李 倩 劉子衿 葉燕彬 夏 穎 張 楓*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院，北京 100069)

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草(agrimonia pilosa ledeb)的地上部分，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒等作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究［1］表明其具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。仙鶴草全草中含有仙鶴草素、仙鶴草內(nèi)酯、甾醇，還含有鞣質(zhì)、黃酮、仙鶴草酚等多種多酚類物質(zhì)［2-5］。植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的多羥基酚類化合物的總稱，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗氧化、抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等多方面作用。于莉等［5-7］的研究已證明仙鶴草多酚具有抗氧化作用，而且仙鶴草的抗腫瘤作用很可能是利用了仙鶴草活性成分中的抗氧化作用。隨著對仙鶴草多酚類物質(zhì)研究的深入，尋找能夠準(zhǔn)確定量測定其多酚的方法是非常必要的。

本研究采取Folin-Ciocalteus法，對仙鶴草中多酚含量的測定條件進(jìn)行了多方面的實(shí)驗(yàn)，并對所確定的實(shí)驗(yàn)條件從方法學(xué)的穩(wěn)定性、精確性、重復(fù)性、回收率等方面進(jìn)行了考察和驗(yàn)證。希望本研究所建立的測定方法能為仙鶴草多酚的定量研究以及開發(fā)利用提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1)儀器:VIS-7220型-可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);BSZ型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);FZ102微型植物式樣粉碎機(jī)(河北黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠);HH-601超級恒溫循環(huán)水浴(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);TGL-16高速臺式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)。

2)藥品材料:沒食子酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803);Folin-Ciocalteus試劑(簡稱FC試劑，德國Merck公司);其他試劑為分析純;水為蒸餾水;仙鶴草購自北京市天天好大藥房。

1.2 研究方法

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的制備:準(zhǔn)確稱取沒食子酸5.19mg，用蒸餾水定容于50mL容量瓶中，此為0.104g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將干燥后的仙鶴草加入粉碎機(jī)中粉碎，并過40目篩，按固液比為1∶30(kg/L)，用60%的乙醇超聲波提取20min。將提取液轉(zhuǎn)移到離心管中，在轉(zhuǎn)速1 200r/min離心6min，留取上層清液，此為仙鶴草樣品溶液。

2)測定波長的選擇:分別定量移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和仙鶴草樣品溶液于10mL的容量瓶中，依次加入2mL蒸餾水，0.5mL FC試劑，1.5mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容。放置60min后，以空白為對照，分別用分光光度計(jì)在400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇最大吸收波長。

3)顯色溫度和時(shí)間的考察:取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3mL于10mL容量瓶中，按照1.2中2)項(xiàng)下方式加入顯色劑，定容后分別放置在 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒溫水浴中加熱反應(yīng)90min，然后測定760nm和660nm處的吸光度，考察反應(yīng)溫度對比色效果的影響。

另取0.3 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，按照1.2中2)項(xiàng)下方式加入顯色劑并開始計(jì)時(shí)。分別在放置 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180 min時(shí)，測定760 nm 和660 nm 處的吸光度，考察反應(yīng)時(shí)間對比色效果的影響。

4)FC試劑和碳酸鈉用量的考察:取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液 0.6 mL，分別加入 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2 mL 的FC 試劑，1.5 mL 的20%碳酸鈉溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室溫反應(yīng)90 min后測定760 nm和660 nm處的吸光值，確定當(dāng)20%碳酸鈉用量一定時(shí)的FC試劑用量。

另取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0.6 mL，加入0.5 mL的FC試劑，分別加入 0.5、0.8、1.2、1.5、1.8、2.1、2.5、3.5 mL的20%碳酸鈉溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室溫反應(yīng)90 min后測定660 nm和760 nm處的吸光值，確定當(dāng)FC試劑的用量一定時(shí)，20%碳酸鈉試劑的用量。

2 結(jié)果

2.1 測定波長的確定

從圖1和圖2的吸收曲線可知，顯色后沒食子酸和仙鶴草樣品在750～770 nm，650～700 nm處有吸收峰。因此本實(shí)驗(yàn)選用760 nm和660 nm為其測定波長。

2.2 顯色溫度和時(shí)間的確定

由圖3可知，在760 nm和660 nm處，隨著溫度的升高，吸光度有逐漸降低的趨勢，選擇室溫25℃為實(shí)驗(yàn)溫度。

由圖4可知，在加入顯色試劑顯色60 min以后，吸光度在760 nm和660 nm處吸光度基本保持穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇90 min為測定時(shí)間。

2.3 FC試劑和碳酸鈉用量的確定

由圖5可知，當(dāng)固定碳酸鈉用量，吸光度大小隨FC試劑量的增加有緩慢的增加，考慮到FC試劑過量后本身的吸收及試劑成本，F(xiàn)C試劑量不是愈大愈好。由圖6可知，當(dāng)固定FC試劑用量，20%碳酸鈉用量在1.0～1.8 mL內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，由于FC試劑與酚類物質(zhì)反應(yīng)要在堿性介質(zhì)條件下進(jìn)行，如加入的堿量少，顯色反應(yīng)會(huì)不完全。結(jié)合這2個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選定FC試劑用量為0.5 mL，20%Na2CO3用量為1.7mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按所確定的實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確移取0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入2 mL蒸餾水，0.5 mL FC試劑，1.7 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，室溫放置90 min后，在760 nm和660 nm處分別測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，總酚濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，760 nm時(shí)的回歸方程為y=0.091 8x+0.012 9，R2=0.999 3見圖7;660 nm時(shí)的回歸方程y=0.084 7x－0.002 6，R2=0.999 7。且均在0～10.4 mg/L有良好的線性關(guān)系，詳見圖8。

2.5 方法評價(jià)

1)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取仙鶴草樣品溶液，按所確定的方法加入顯色劑后，每隔15 min測量1次吸光度。180 min內(nèi)在760 nm的吸光度變化情況為:0.425、0.435、0.437、0.437、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.440、0.438，RSD 為0.9%。在660 nm的吸光度變化情況為:0.379、0.391、0.392、0.393、0.392、0.394、0.394、0.395、0.394、0.395、0.395、0.395，RSD為1.1%。該實(shí)驗(yàn)方法對于仙鶴草樣品在3h之內(nèi)吸光度是穩(wěn)定的。

2)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn):取同1批仙鶴草樣品5份，按所確定的方法測定吸光度，在760 nm的吸光度為0.446、0.449、0.450、0.442、0.444、0.442，RSD 為0.8%。在660 nm的吸光度為0.400、0.405、0.406、0.400、0.400、0.393，RSD 為 1.6%。

3)精密度實(shí)驗(yàn):取1份仙鶴草樣品，按所確定的方法測定吸光度，重復(fù)測定6次，在760 nm測定其吸光度為 0.421、0.431、0.441、0.434、0.437、0.435，RSD為1.6%。在660 nm測定其吸光度為0.380、0.390、0.397、0.389、0.396、0.387，RSD 為 1.6%。

4)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，將已知量的沒食子酸樣品，分別加入已知總酚含量的仙鶴草樣品中，按上述所確定的方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表1。

表1 仙鶴草加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of recovery of added standard to agrimonia pilosa ledeb

2.6 仙鶴草總酚含量測定

按上述方法制備及測定的7份夏枯草樣品，計(jì)算每100克仙鶴草中含有多酚的量分別為:在760 nm處其總酚平均值為4.70 g/100g，RSD為1.0%;在660 nm處總酚平均值為4.75 g/100 g，RSD為1.2%。

3 結(jié)論

天然多酚類物質(zhì)在植物中廣泛存在，不僅種類和數(shù)量繁多，而且存在的形式既復(fù)雜又多種多樣。所以針對不同的天然物質(zhì)中的多酚，測定方法可以有多方面選擇，如可采用Folin-Ciocalteus法、Folin-Denis法、鐵氰化鉀法、酒石酸亞鐵法等［8-9］。本文以沒食子酸為對照品，采用Folin-Ciocalteus法測定仙鶴草中的多酚含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所選定的實(shí)驗(yàn)條件下，無論是采用吸收波長760nm還是660nm，本實(shí)驗(yàn)所建立的測定仙鶴草中總多酚含量的方法，在穩(wěn)定性、精密性、重復(fù)性以及回收率方面都有很好結(jié)果，可以為仙鶴草總多酚定量分析的研究方法提供參考。

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