宮頸上皮內(nèi)瘤變與正常宮頸組織差異表達(dá)蛋白分析

何 玥 吳玉梅* 趙 群 王曉麗 陳 碩 錢(qián)小紅 張玉祥

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006;2.北京蛋白質(zhì)組中心，北京 102206;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，北京 100069)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是宮頸癌的癌前病變，文獻(xiàn)［1］報(bào)道北京地區(qū)25～54歲已婚婦女CIN的患病率為5.84%，其中CINⅠ為 4.65%，CINⅡ?yàn)?0.80%，CINⅢ為0.38%，CIN總體發(fā)展為原位癌的概率為正常子宮頸的20倍，發(fā)展為浸潤(rùn)癌的概率為正常子宮頸的7倍［2－4］。因此對(duì)于CIN的篩查顯得尤為重要，目前臨床醫(yī)師希望能夠找到一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，敏感性、特異性高，假陽(yáng)性、假陰性率低的方法，早期篩查及診斷CIN［5］。由于從正常宮頸發(fā)展為CIN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，尋找有效的阻斷正常宮頸向?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展的靶點(diǎn)也是迫切需要解決的問(wèn)題。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究CIN組織與正常宮頸組織之間差異蛋白質(zhì)表達(dá)，并對(duì)其中顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium－binding protein A9，S100A9)、丙酮酸激酶 M2(pyruvate kinase M2，PKM2)和真核延長(zhǎng)因子 1A1(eukaryotic elongation 1－alpha－1，eEF1A1)應(yīng)用免疫組化及蛋白印記 2種方法從定性及定量角度進(jìn)行驗(yàn)證。篩選出CIN組織中的差異蛋白，為篩查及診斷CIN以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1)蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)象:篩選2008年8月至2009年9月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科收治患者的子宮頸組織32例，其中CIN組23例(CINⅠ為7例、CINⅡ?yàn)?例、CINⅢ為8例)，對(duì)照組(即因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的正常子宮頸組織)9例，患者年齡22～72歲，平均年齡(41.0±12.1)歲。選取納入標(biāo)準(zhǔn):行子宮頸錐形切除術(shù)或子宮切除術(shù)術(shù)后病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往行化療或放療患者;②既往因CIN行手術(shù)或其他治療患者。術(shù)中收集切除病變組織，30 min內(nèi)放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。

2)免疫組織化學(xué)研究對(duì)象:篩選2011年2月至3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科收治患者的子宮頸組織40例，患者年齡22～72歲。納入斷及排除標(biāo)準(zhǔn)同蛋白質(zhì)組學(xué)。其中正常、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組各10例。

3)蛋白免疫印跡研究對(duì)象:篩選同期首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科收治的子宮頸組織36例，患者年齡在22～72歲。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同蛋白質(zhì)組學(xué)。其中正常、CINⅠ～Ⅱ及CINⅢ組各12例。

以上病理診斷均經(jīng)2名病理學(xué)專家核實(shí)，納入患者均簽署知情同意書(shū)并由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 主要試劑與儀器

1)蛋白組學(xué)試劑:蛋白酶抑制劑，樣品裂解液，IPG膠條(IPGstrip，pH3～10)、聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)及熒光標(biāo)志物 Cy2、Cy3、Cy5均為瑞典 Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品。

2)IHC及Western blotting試劑:β－actin抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司、一抗為兔抗人PKM2多抗、兔抗人eEF1A1多抗、鼠抗人S100A9單抗，二抗為羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司;PV－9000試劑盒及DAB試劑盒均購(gòu)自Lab Vision公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甘氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光液、超敏發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

3)主要儀器:等電聚焦儀 IPGphor、Typhoon9410型掃描儀、MALDI－TOF/TOF MS 均為美國(guó) Applied Biosystem公司產(chǎn)品;垂直電泳儀為Ettan DaltSix公司產(chǎn)品、DeCyderTM2D Version 6.5軟件為瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)組織總蛋白抽提:將凍存組織標(biāo)本迅速研磨至粉末狀，經(jīng)過(guò)蛋白裂解液裂解，手工勻漿及超聲波粉碎細(xì)胞1 min、混勻、高速離心取上清液即為宮頸組織的總蛋白，采用改良Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。

2)二維熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluo－rescence difference in gel electrophoresis，2－D DIGE)2－D DIGE分離宮頸組織蛋白:用Cy2、Cy3、Cy5熒光染料標(biāo)記待測(cè)樣品，整個(gè)操作避光進(jìn)行。遵循正反標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的原則，Cy2標(biāo)記混合樣品(內(nèi)標(biāo))，Cy3及Cy5分別標(biāo)記CINⅠ和對(duì)照組、CINⅡ和CINⅠ組、CINⅢ和CINⅡ組進(jìn)行二維電泳，共制膠3塊。使用IPG等點(diǎn)聚焦系統(tǒng)進(jìn)行雙向凝膠電泳第1向，每個(gè)膠條的上樣量均為 150 μg，總體積 450 μL，水平電泳儀電泳(24 cm IPG固向膠條、線性、pH3～10)，聚焦參數(shù)(30、60V 各 6 h，100、250、500、1 000、10 000V 各 1 h，最后10 000V 8 h)。膠條平衡15 min后進(jìn)行第2向垂直電泳即十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE):以電流 10 mA 運(yùn)行 1 h，15 mA 運(yùn)行15 h，直至溴酚藍(lán)沿前沿移至凝膠底邊停止電泳。二維電泳后，用Typhoon9410型掃描儀掃描得到二維熒光差異凝膠電泳的蛋白表達(dá)圖像，用DeCyderTM2D version 6.5軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，包括蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)、背景消減、標(biāo)準(zhǔn)化、匹配、建立平均凝膠、進(jìn)行差異分析等，以確立差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

3)MALDI－TOF－MS 技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜及蛋白質(zhì)查詢:從熒光染色的制備膠中選取三維豐度比值在1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)做質(zhì)譜鑒定。用人工方法切膠、洗膠、脫色、脫水、原位酶解，然后進(jìn)行樣品萃取、點(diǎn)樣。采用美國(guó) ABI－4800 型 MALDI－TOF－MS 進(jìn)行質(zhì)譜分析。測(cè)定肽質(zhì)量數(shù)和二級(jí)序列，并測(cè)定整體蛋白質(zhì)量數(shù)，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass finger printing，PMF)。利用 ABI 4800 GPS軟件檢索 IPIHUMAN V3.52數(shù)據(jù)庫(kù)尋找理論上酶解肽段能與之相匹配的蛋白，以結(jié)合蛋白質(zhì)在膠上的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)。

4)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC):將MALDI－TOF/TOF MS檢測(cè)出差異表達(dá)蛋白進(jìn)行IHC驗(yàn)證。收集標(biāo)本4%甲醛固定后，石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化，PBS洗，高壓檸檬酸6.0修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶;滴加一抗(兔抗人PKM2多抗1:100;兔抗人eEF1A1多抗1:200;鼠抗人S100A9單抗1:40)，孵育過(guò)夜;滴加二抗(非生物素化PV－9000)，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染脫水、封片，光鏡觀察。以已判斷為正常宮頸組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。定性結(jié)果判讀:細(xì)胞無(wú)染色為0分，細(xì)胞染色呈淺黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):高倍視野(400×)下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜5%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率6% ～25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率為26% ～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率51%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＞75%計(jì)4分。將項(xiàng)評(píng)分相乘后，0分為陰性(－)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。(－)與(+)為低表達(dá)，定義為陰性。(++)與(+++)為高表達(dá)定義為陽(yáng)性。

5)蛋白印記:將 MALDI－TOF/TOF MS檢測(cè)出差異表達(dá)蛋白再進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證。將冷凍組織約20 mg裂解液及離心后，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配10%分離膠，4%濃縮膠，上樣電泳。濃縮膠電壓70V，分離膠電壓100V，待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳;電轉(zhuǎn)膜60 min，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶室溫封閉1 h，將PVDF膜孵育稀釋的一抗(兔抗人PKM2多抗、兔抗人eEF1A1多抗、鼠抗人S100A9單抗，1:2 000)，4℃過(guò)夜。加入二抗(相應(yīng)抗鼠或抗兔第二抗體，1:2 000)，與膜共同常溫孵育1 h，孵育后LAS 3000曝光觀察轉(zhuǎn)移效果，在58 000、50 000、14 000處出現(xiàn)顯色帶為陽(yáng)性，無(wú)顯色帶出現(xiàn)為陰性，選取條帶最清晰圖像儲(chǔ)存。半定量結(jié)果判讀:LAS3000曝光后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，應(yīng)用IMAGE J軟件對(duì)對(duì)照組、CINⅠ～Ⅱ組及CINⅢ組PVDF膜同種蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行灰度掃描，再對(duì)同張PVDF膜上β－actin進(jìn)行灰度掃描。通過(guò)灰度計(jì)算PKM2、eEF1A1及S100A9 3種蛋白占β－actin的比例進(jìn)行比較計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料行單因素方差分析，組間比較采用兩兩比較檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-D DIGE檢測(cè)差異蛋白及MALDI-TOF/TOF MS鑒定結(jié)果

DeCyder軟件分析(設(shè)置三維豐度比值在1.5倍以上)結(jié)果顯示CINⅠ和正常宮頸組、CINⅡ和CINⅠ組及CINⅢ和CINⅡ組組織蛋白圖像(圖1)。以正常宮頸組織為對(duì)照，比較各組CIN組織，有46個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)(P＜0.05)(圖2)。差異蛋白采用MALDI－TOF/TOF MS成功鑒定出25個(gè)蛋白質(zhì)，上調(diào)蛋白質(zhì)點(diǎn)9個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)點(diǎn)15個(gè)，1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(PKM2)同時(shí)出現(xiàn)于上調(diào)及下調(diào)組。選出上調(diào)顯著的S100A9蛋白、下調(diào)顯著的eEF1A1蛋白及同時(shí)出現(xiàn)于上調(diào)組與下調(diào)組的PKM2蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖1 二維熒光差異凝膠電泳圖像Fig.1 Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis(2-D DIGE)image

圖2 DeCyder軟件分析得出的46個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)Fig.1 Analysis of the 46 differential proteins by DeCyder software

2.2 免疫組織化學(xué)定性驗(yàn)證結(jié)果

S100A9蛋白在正常宮頸組織及CIN病變組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，CIN組織中S100A9蛋白表達(dá)陽(yáng)性高于正常宮頸組織(圖3)，各組間陽(yáng)性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。eEF1A1在正常宮頸組織及CIN病變組織主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，PKM2蛋白在正常宮頸組織及CIN病變組織主要表達(dá)于細(xì)胞核，均呈棕黃色顆粒，在CIN組織中eEF1A1及PKM2蛋白表達(dá)陽(yáng)性稍低于正常宮頸組織(圖4，5)，各組間陽(yáng)性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖5 免疫組化染色顯示PKM2蛋白在宮頸組織中的表達(dá)情況Fig.5 PKM2 protein expression in cervical tissue detected by IHC staining(SP，400×)

2.3 蛋白印記半定量驗(yàn)證結(jié)果

應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)S100A9、eEF1A1及PKM2蛋白在正常宮頸、CINⅠ～Ⅱ、CINⅢ組織中的表達(dá)情況(圖6)。隨宮頸病變加重，S100A9蛋白表達(dá)水平明顯增高，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.341，P=0.010)。eEF1A1蛋白的表達(dá)有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.151，P=0.861)。PKM2蛋白表達(dá)下調(diào)，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.588，P=0.000)。其中在S100A9蛋白和PKM2蛋白中，CINⅢ組和正常宮頸比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為 F=5.402，P=0.030;F=5.903，P=0.024)(表1)。

圖6 Western blotting法測(cè)定宮頸組織中S100A9、eEF1A1、PKM2蛋白表達(dá)Fig.6 S100A9、eEF1A1、PKM2 proteins expression in cervical tissue detected by Western blotting

表1 3組宮頸組織中S100A9、eEF1A1、PKM2差異蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of different protein expression of S100A9、eEF1A1、PKM2 among three groups of cervical tissue(±s)

表1 3組宮頸組織中S100A9、eEF1A1、PKM2差異蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of different protein expression of S100A9、eEF1A1、PKM2 among three groups of cervical tissue(±s)

Differences between ① and ③ within group in S100A9/β－Actin and PKM2/β－Actin are both significant，P ＜0.05(the former F/P=5.402/0.03，the later F/P=5.903/0.024)，S100A9:S100 calcium－binding protein A9;PKM2:pyruvate kinase M2;eEF1A1:eukaryotic elongation factor 1－alpha 1;CIN:cervical intraepithelial neoplasia.

Group Number S100A9/β－Actin eEF1A1/β－Actin PKM2/β－Actin①Control(normal cervix)12 0.098±0.092 0.513±0.208 0.630±0.146②CINⅠ～Ⅱ 12 0.142±0.160 0.505±0.253 0.319±0.181③CINⅢ 12 0.551±0.185＊＊ 0.551±0.185 0.268±0.215＊＊F/P 36 5.341/0.010 0.151/0.861 13.588/0.000

3 討論

3.1 CIN組織與正常宮頸組織差異蛋白組學(xué)研究意義

CIN是與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的一組癌前病變，它反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展由量變到質(zhì)變的過(guò)程。CIN患者總體大約有20%～50%恢復(fù)正常，CINⅠ中有11.6%逆轉(zhuǎn)，27.8%持續(xù)不變，1%癌變;CINⅡ中有36.3%逆轉(zhuǎn)，23.1%持續(xù)不變，5.0%癌變;CINⅢ中12.0%～22.0%癌變，總體發(fā)展為子宮頸浸潤(rùn)癌的概率為15%［1－4］。蛋白質(zhì)是實(shí)現(xiàn)基因功能表達(dá)的最終物質(zhì)，因此，直接測(cè)定蛋白質(zhì)的水平和活性是了解細(xì)胞活動(dòng)的最佳方法。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要包括分離技術(shù)和鑒定技術(shù)，2－D DIGE檢測(cè)［2］是唯一應(yīng)用內(nèi)參照的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，蛋白表達(dá)水平最快、最靈敏、最準(zhǔn)確的方法。MALDI－TOF/TOF MS為代表的質(zhì)譜技術(shù)也已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析鑒定［3－4］，該技術(shù)可得到用于微量樣本分類的蛋白質(zhì)組合。目前已有許多應(yīng)用上述2種方法對(duì)CIN組織、黏液、脫落細(xì)胞以及血清血漿蛋白進(jìn)行診斷性及治療性研究［5－9］。本研究采用上述2種蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法對(duì)CIN與正常宮頸組織鑒定出差異蛋白，并應(yīng)用IHC及Western blotting驗(yàn)證與蛋白組學(xué)得到結(jié)果一致，為CIN組織中差異蛋白作為新的篩查標(biāo)志物提供重要證據(jù)，并為研究CIN發(fā)生的分子機(jī)制及臨床診治工作提供新的依據(jù)。

3.2 S100A9蛋白表達(dá)隨CIN級(jí)別加重而逐漸升高

S100A9蛋白是S100家族成員，蛋白分子質(zhì)量為14 000，定位于1q21，該區(qū)段染色體穩(wěn)定性較差，與其他基因構(gòu)成表皮分化復(fù)合物，參與上皮細(xì)胞的最終分化，易發(fā)生多種染色體重排［10］。Cheng P 等［11］報(bào)道S100A8/A9蛋白復(fù)合物參與線粒體氧化體系中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位細(xì)胞色素b558的激活，而NADPH氧化過(guò)程異?？梢援a(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)［12］。ROS可以降低線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。朱雪潔等［14］采用免疫組化SP方法檢測(cè)S100A9蛋白表達(dá)從正常宮頸組織到CIN逐漸增高，且隨CIN級(jí)別的加重逐漸升高，說(shuō)明S100A9蛋白參與了宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生發(fā)展。Qin F等［15］報(bào)道S100A9蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變表達(dá)與正常宮頸組織比較下調(diào)。本研究中應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)隨CIN級(jí)別升高，S100A9蛋白表達(dá)水平逐漸增高，與朱雪潔等［14］報(bào)道相一致。本研究IHC示S100A9蛋白表達(dá)于各組子宮頸組織細(xì)胞質(zhì)中，在CIN組織中蛋白表達(dá)高于正常宮頸組織，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。由正常宮頸組→CINⅡ組表達(dá)陽(yáng)性逐漸升高，但CINⅢ組稍低于對(duì)照組及CINⅠ～Ⅱ組，考慮S100A9蛋白的表達(dá)可能與上皮或癌的角化程度有關(guān)，由于樣本量較小，只能定性的驗(yàn)證S100A9蛋白在各組子宮頸組織中均有表達(dá)及表達(dá)位置，因此應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測(cè)。Western blotting的半定量法驗(yàn)證提示從正常宮頸組→CINⅢ組S100A9蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)，CINⅢ組表達(dá)率遠(yuǎn)高于對(duì)照組及CINⅠ～Ⅱ組 (P=0.005)，定量與定性驗(yàn)證均與2－D DIGE結(jié)果基本相符。S100A9表達(dá)水平的升高可能提示宮頸病變的嚴(yán)重程度。進(jìn)一步研究S100A9蛋白表達(dá)水平與子宮頸病變組織角化程度的相關(guān)性將有助于明確這種蛋白對(duì)CIN診斷的參考價(jià)值。

3.3 eEF1A1蛋白表達(dá)隨CIN級(jí)別加重有降低趨勢(shì)

真核翻譯延長(zhǎng)因子1A(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha，eEF1A)是人類基因，而 eEF1A1蛋白是其表達(dá)產(chǎn)物。eEF1A1蛋白基因位于染色體6q14，廣泛存在于正常人體組織細(xì)胞，作為延長(zhǎng)因子直接與氨基酰－tRNA結(jié)合，將其運(yùn)至核糖體A位，使肽鏈延長(zhǎng)，具有GTP酶活性，保證蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和速度。eEF1A1參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括胚胎發(fā)生、致癌性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增生及細(xì)胞支架形成等［16］。目前Leclercq T M 等［17－18］報(bào)道在許多腫瘤組織中eEF1A1 蛋白為過(guò)表達(dá)，但eEF1A1蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變中研究較少。本研究應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)eEF1A1蛋白在正常宮頸組→CINⅢ組表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。IHC結(jié)果顯示eEF1A1蛋白表達(dá)于各組子宮頸組織細(xì)胞質(zhì)中，由正常宮頸組→CINⅢ組表達(dá)陽(yáng)性有下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.550)。進(jìn)一步行Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eEF1A1蛋白的表達(dá)水平與CIN的相關(guān)性，結(jié)果示eEF1A1蛋白隨病變程度加重表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.861)，定量與定性驗(yàn)證均與2－D DIGE結(jié)果基本相符。

3.4 PKM2蛋白隨CIN級(jí)別升高逐漸降低

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，有4種同工酶:L、R、M1、M2型，這4種同工酶的分布具有組織特異性。PKM2蛋白表達(dá)于一些分化組織，如肺臟、脂肪組織、視網(wǎng)膜及核酸合成旺盛的所有細(xì)胞，這些細(xì)胞都是增生細(xì)胞，包括正常增生細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞［19－20］。PKM2蛋白存在三聚體和二聚體2種形式，前者對(duì)底物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoendpyruvate，PEP)的親和力高，決定了PKM2蛋白同工酶的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn);后者也稱為T(mén)u M2－PK(pyruvate kinase tumor M2)與PEP的親和力弱，在細(xì)胞正常PEP濃度時(shí)無(wú)活性，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖可合成核酸、磷脂以及氨基酸，大量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)變成乳酸，此相對(duì)于糖酵解的過(guò)程，可稱之為谷氨酸酵解過(guò)程，以保證細(xì)胞中能量的供給高水平1，6 － 二磷酸果糖(fructose－1，6－bisphosphate，F(xiàn)PBP)以及色氨酸的產(chǎn)生又可使PK由二聚體向三聚體轉(zhuǎn)化，通過(guò)糖酵解過(guò)程，PK作用下導(dǎo)致能量?jī)羯桑瑥亩种艱NA合成和細(xì)胞增生。Landt S等［21］對(duì)子宮頸癌前病變Tu M2－PK進(jìn)行了檢測(cè)分析，采用定量的免疫分析法發(fā)現(xiàn)Tu M2－PK在CINⅠ～Ⅲ組間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并采用免疫組織化學(xué)驗(yàn)證了上述結(jié)論。白曉卉等［22］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)篩選宮頸黏膜上皮細(xì)胞株H8與人子宮頸癌細(xì)胞株Caski中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)PKM2蛋白在Caski中的表達(dá)顯著高于H8，并采用免疫印跡方法檢測(cè)了由正常宮頸組→CINⅢ組，PKM2蛋白的表達(dá)水平逐漸增高。本研究中應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常宮頸組→CINⅢ組，PKM2蛋白同時(shí)見(jiàn)于差異蛋白表達(dá)上調(diào)組及下調(diào)組，應(yīng)用IHC定性檢測(cè)PKM2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PKM2蛋白在各組子宮頸組織細(xì)胞核中均有表達(dá)，正常宮頸組→CINⅢ組表達(dá)陽(yáng)性下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.550)，需擴(kuò)大樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。而Western blotting半定量驗(yàn)證提示PKM2蛋白表達(dá)水平由正常宮頸組→CINⅢ組逐漸降低，各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，定量與定性驗(yàn)證均與2－D DIGE結(jié)果基本相符。本研究結(jié)果提示PKM2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)與宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生及病變加重發(fā)生密切相關(guān)，與Landt S 等［21］和白曉卉等［22］報(bào)道結(jié)果不一致，考慮PKM2蛋白可能同時(shí)以二聚體及三聚體的形式存在，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。

本研究通過(guò)2－D DIGE 與MALDI－TOF/TOF MS 結(jié)合，篩選出CIN與正常宮頸組織中25種差異表達(dá)蛋白，選取鑒定差異蛋白上調(diào)組中的S100A9、下調(diào)組中的eEF1A1及同時(shí)出現(xiàn)于上調(diào)及下調(diào)組中的PKM2。應(yīng)用免疫組化及蛋白印跡進(jìn)行驗(yàn)證了質(zhì)譜分析結(jié)果。上調(diào)蛋白S100A9可能作為CIN的相關(guān)標(biāo)志物，下調(diào)蛋白PKM2則可能為抑制CIN發(fā)生發(fā)展的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步深入研究正常宮頸發(fā)展為CIN的差異蛋白質(zhì)組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)一步深入研究相關(guān)蛋白變化機(jī)制，為尋找具有普遍性意義的CIN篩查腫瘤標(biāo)志物提供前期研究和候選蛋白，進(jìn)而為CIN的早期診斷、防治以及預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展提供依據(jù)，為CIN從分子水平找到新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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