他莫昔芬介導的絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜pten基因突變的檢測

郭 蕾 李文君 馬雪蓮 馮力民

(首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100050)

他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是乳腺癌術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療應(yīng)用最為廣泛的藥物，但TAM治療乳腺癌的同時對子宮內(nèi)膜則產(chǎn)生類雌激素樣激動作用，長期使用可以使子宮內(nèi)膜增生甚至癌變［1］，其發(fā)生機制尚不明確。

磷酸酶張力蛋白抑癌基因(phosphatase and tensin，pten)是子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因，被公認為子宮內(nèi)膜的“看家基因［2］”。本研究選取服用TAM的絕經(jīng)期患者的子宮內(nèi)膜，以絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜癌患者及絕經(jīng)期正常子宮內(nèi)膜為對照，采用聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)及DNA雙向測序法檢測pten基因外顯子的突變情況，探討其與TAM介導的子宮內(nèi)膜病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。為臨床預防及治療TAM相關(guān)內(nèi)膜病變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

所有子宮內(nèi)膜標本采集于2007年至2010年間在首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院婦產(chǎn)科住院治療的絕經(jīng)期患者。納入的75例病例均為絕經(jīng)后患者，以排除激素水平對TAM作用的影響。共分為3組，實驗組為服用TAM的子宮內(nèi)膜組(33例)，均為乳腺癌術(shù)后服用TAM的絕經(jīng)期患者，每日服TAM 10 mg，Bid，平均服藥時間為(17.15±16.58)月。因出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血或定期隨訪B超提示子宮內(nèi)膜增厚，住院宮腔鏡檢查獲得子宮內(nèi)膜標本?；颊咂骄挲g(56.5±10.1)歲，平均絕經(jīng)時間(7.3±8.9)年。對照組為子宮內(nèi)膜腺癌組(22例)，子宮內(nèi)膜標本臨床病理分期為Ⅰ期的子宮內(nèi)膜癌?；颊咂骄挲g為(59.1±9.5)歲，平均絕經(jīng)時間(9.1±7.6)年;正常子宮內(nèi)膜組(20例)，為因患子宮脫垂入院行子宮切除術(shù)的絕經(jīng)期患者，術(shù)后子宮內(nèi)膜病理檢查除外子宮內(nèi)膜增生性病變和癌變?；颊咂骄挲g(63.5±7.7)歲，平均絕經(jīng)時間(13.2±7.5)年。

1.2 方法

1)標本采集:離體子宮內(nèi)膜標本立即無菌操作下留取部分置液氮中速凍，然后置－80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2)組織DNA提取:－80℃冰箱取組織塊，室溫解凍，加Trizol液(1 mL/10 cm2)，充分研磨;加入氯仿，低溫離心;吸取上清，剩余有機相和中間層加入無水乙醇，混勻，低溫離心;棄上清，加0.1 mmol的檸檬酸鈉洗沉淀，室溫放置30 min，75%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥 DNA沉淀5～10 min，加入適量含8 nmol NaOH的無菌蒸餾水溶解。

3)Pten基因9個外顯子(ex)PCR-SSCP步驟:總反應(yīng)體系25 μL，加上、下游引物，加DNA聚合酶Mastermix 12.5 μL;加模板 DNA 各 1 μL;加滅菌蒸餾水至25 μL反應(yīng)體系，分別按各自反應(yīng)條件進行PCR擴增。反應(yīng)條件:ex1:預變性(94℃)，3 min;變性94 ℃，30 s;退火60 ℃，30 s;延伸(72 ℃)，30 s;后延伸72 ℃，7 min，35 個循環(huán);ex2、3、4:預變性(94 ℃)，3 min;變性94℃，40 s;退火 46 ℃，40 s;延伸(72 ℃)，60 s;后延伸72 ℃，7 min，45 個循環(huán);ex5、6、7、8、9:預變性 94 ℃，3 min;變性 94 ℃，40 s;退火58 ℃，40 s;延伸72 ℃，60 s;后延伸72 ℃，7 min，35個循環(huán)。

4)瓊脂糖凝膠電泳:取PCR產(chǎn)物5 μL以2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，紫外燈下觀察確認擴增成功。聚丙烯酰胺凝膠快速銀染法(SSCP):加等體積(各10 μL)變性緩沖液置99℃變性10 min，變性后標本各取20 μL以聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓120V，約40 min?？焖巽y染并拍照。

1.3 結(jié)果判斷

以正常子宮內(nèi)膜組織的DNA(標準Marker)擴增產(chǎn)物的SSCP帶型為陰性對照，如出現(xiàn)單鏈DNA條帶數(shù)目增加、減少或位置的相對位移為陽性結(jié)果，篩選為可疑突變標本，再對目標基因行PCR擴增100 μL，透析袋電洗脫純化后進行DNA雙向測序，并與NCBI基因庫序列進行比較(序列號:AF067844)，確認有無突變發(fā)生和突變位點及種類。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，各組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗比較，所得數(shù)據(jù)用Fisher's確切概率法進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSCP篩選結(jié)果及DNA雙向測序

PCR-SSCP電泳篩選出20個出現(xiàn)異常單鏈DNA條帶的外顯子(圖1A－E所示)。

將篩選出的目標基因行PCR擴增后由諾賽基因公司做DNA雙向測序，結(jié)果(圖2A－D)與NCBI基因庫序列進行比較(序列號:AF067844)，確認TAM組和子宮內(nèi)膜癌組分別有4例和5例發(fā)生突變(表1，2)，突變率分別為12.12%(4/33)和22.72%(5/22)。

Pten基因突變樣本DNA測序結(jié)果(圖2A－D):

表1 各組pten基因突變情況Tab.1 Pten mutation of nine exons in 3 groups

圖1 Pten基因外顯子PCR-SSCR電泳結(jié)果Fig.1 The PCR-SSCR result of Pten exon

2.2 3組基因突變率比較

TAM組和子宮內(nèi)膜癌組分別有4例和5例發(fā)生基因突變，突變率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);正常子宮內(nèi)膜組無基因突變，突變率0%(0/20)，TAM組與正常子宮內(nèi)膜組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表1，2。

3 討論

3.1 他莫昔芬對乳腺癌患者子宮內(nèi)膜的影響

乳腺癌已成為當今女性健康的第一殺手，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年增長的趨勢。近10年來其發(fā)病率上升的同時病死率呈下降趨勢，其原因與術(shù)后輔助化療和內(nèi)分泌治療密切相關(guān)，患者的長期生存率大大提高。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是乳腺癌內(nèi)分泌治療中應(yīng)用最為廣泛的藥物，用于雌激素敏感性乳腺癌術(shù)后的輔助治療，60%～70%的乳腺癌患者術(shù)后需連續(xù)服用TAM 5年。20多年的臨床應(yīng)用證明其療效肯定。2002年，美國臨床腫瘤學會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)建議，目前5年的TAM治療仍是雌激素受體(ER)陽性者的標準治療方案。TAM在乳腺癌術(shù)后預防復發(fā)轉(zhuǎn)移的輔助治療及解救治療中都有十分重要的地位［3］。TAM同時也是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，對不同靶器官間有雌激素和/或抗雌激素樣的雙重作用，在乳腺組織可產(chǎn)生拮抗雌激素的作用，而對子宮內(nèi)膜則產(chǎn)生類雌激素樣激動作用，長期使用可引起子宮內(nèi)膜病變，甚至癌變［1］。

研究［5］發(fā)現(xiàn)他莫昔芬的作用隨著周圍雌二醇(E2)的濃度的變化而表現(xiàn)不同，對于激素低水平［E2＜20pg/mL，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)＞40 mIU/mL］的絕經(jīng)后婦女則是一種弱的雌激素激動劑，表現(xiàn)出類雌激素樣作用，一系列內(nèi)膜異常與其使用有關(guān)，可造成內(nèi)膜增生、良性息肉甚至癌變。子宮內(nèi)膜息肉是絕經(jīng)后婦女服用他莫昔芬后最常見的子宮內(nèi)膜病理類型，TAM治療者子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生率高于未用藥者(8%～36%:0～10%)［4］。大多數(shù)患者無癥狀。TAM相關(guān)子宮內(nèi)膜息肉惡變率為3.0% ～10.7%。多發(fā)性息肉及局灶性增生是癌變的重要起源［5］。有學者［6］觀察每1 000個無癥狀婦女發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的危險估計為1.7，服用TAM可使這一危險提高2～3倍，依賴于累計劑量和服用時間。一些流行病學研究及臨床試驗［7］也已證實乳腺癌患者在長時間服用TAM后發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的危險性增加。1996年，國際癌癥研究組織正式將TAM劃歸為人類子宮內(nèi)膜致癌物。

3.2 他莫昔芬介導的子宮內(nèi)膜病變發(fā)病機制研究現(xiàn)狀

表2 Pten基因各外顯子突變情況Tab.2 Pten mutation of nine exons

目前對TAM相關(guān)子宮內(nèi)膜病變的形態(tài)學改變研究較多，但其作用機制尚不明確。有研究［8］發(fā)現(xiàn)TAM不僅影響雌激素相關(guān)靶基因的表達，而且調(diào)控一系列獨特的基因表達，認為雌激素和TAM通過影響細胞信號傳導途徑如調(diào)節(jié)下游區(qū)的效應(yīng)基因PAX2啟動子低甲基化來參與子宮內(nèi)膜細胞的增生和癌變過程。Pole J C等［9］研究了在原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜細胞中TAM誘導的基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，TAM組出現(xiàn)了許多基因的改變，這些改變和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控和信號的轉(zhuǎn)導有關(guān)。Monte N M等［10］在正常增生、癌前、子宮內(nèi)膜腺癌組織中進行Pten和 PAX2免疫染色，對總體患病率和聯(lián)合PAX2-Pten基因表達缺失進行了統(tǒng)計學分析。認為這2個基因的功能同時喪失是導致一種癌前病變轉(zhuǎn)化為癌的重要因素。

Pten是繼p53之后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中第2個突變率較高的基因，也是目前已知的子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因，是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期事件，被視為子宮內(nèi)膜的“看家基因”。Pten基因失活與細胞信號轉(zhuǎn)導、腫瘤發(fā)病機制、浸潤轉(zhuǎn)移、惡性轉(zhuǎn)化、無限制生長和臨床預后等有一定關(guān)系。Pten基因失活機制主要包括等位基因缺失、基因突變、甲基化、mRNA和蛋白表達降低或失表達，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，其中基因突變是最常見的Pten基因失活方式［11］。許多學者通過對子宮內(nèi)膜癌、非典型增生組織中抑癌基因Pten突變和表達缺失與臨床意義的探討，得知由Pten基因突變和表達缺失導致的Pten功能喪失，是子宮內(nèi)膜癌的早期分子事件，在子宮內(nèi)膜過度增生發(fā)展至子宮內(nèi)膜癌前病變中起著重要作用［12］。更有學者［13］證實Pten也可作為癌前病變——子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤樣增生(EIN)的預測及轉(zhuǎn)歸的重要指標之一。觀察［12］提示，與p53相比，Pten失活可能作用于子宮內(nèi)膜癌早期，或許可以作為早期子宮內(nèi)膜癌及癌前病變的診斷指標。

3.3 研究服用TAM的絕經(jīng)期患者子宮內(nèi)膜Pten基因失活機制的意義

目前國內(nèi)外對子宮內(nèi)膜癌中Pten基因研究較多，但對服用TAM的患者子宮內(nèi)膜中Pten基因的研究相關(guān)報道尚少。那么TAM是否也通過引起Pten基因的失活，從而成為其導致子宮內(nèi)膜癌的驅(qū)使因素，是本研究的重點。

國內(nèi)邢風玲等［14］采用LSAB二步法檢測了服用TAM絕經(jīng)期患者子宮內(nèi)膜PTEN蛋白表達情況，并以絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜癌及正常絕經(jīng)期內(nèi)膜中PTEN蛋白表達做對照，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在正常絕經(jīng)人群中呈高表達、服用TAM的絕經(jīng)人群呈中表達、絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜中呈低表達，提出PTEN蛋白表達降低可能為TAM介導的子宮內(nèi)膜癌的早期分子事件。

本實驗檢測了服用TAM絕經(jīng)期婦女子宮內(nèi)膜Pten基因外顯子突變情況。服用TAM組與正常子宮內(nèi)膜組相比差異雖無統(tǒng)計學意義，但其突變率明顯高于正常組，且與子宮內(nèi)膜癌組比較差異無統(tǒng)計學意義，預測如加大樣本量可能差異會有統(tǒng)計學意義。本研究表明Pten基因突變可能在服用TAM的絕經(jīng)期患者的子宮內(nèi)膜過度增生發(fā)展至子宮內(nèi)膜癌前病變中起重要作用，可能是TAM介導的子宮內(nèi)膜癌的早期分子事件，其意義有待擴大樣本例數(shù)并對服用TAM前基礎(chǔ)病變做前瞻性對照研究進一步驗證。

臨床上為服用TAM達到足夠的療程，往往采取切除子宮的方法來預防子宮內(nèi)膜的病變，但對患者的損傷較大，國內(nèi)馮力民等［15］開展了在患者服用TAM前采用宮腔鏡微創(chuàng)治療行子宮內(nèi)膜去除術(shù)，術(shù)后繼續(xù)服用TAM的研究。目前已有32例患者術(shù)后隨訪5年，未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉復發(fā)及惡性病變。目前尚缺乏大樣本的前瞻性基礎(chǔ)實驗為其提供分子生物學依據(jù)并且證實其療效。如果能證實TAM也通過引起Pten基因的失活，從而成為其導致的子宮內(nèi)膜癌的驅(qū)使因素，不僅能為TAM引起子宮內(nèi)膜癌變提供分子生物學證據(jù)，作為預測服用TAM患者的子宮內(nèi)膜細胞是否失去分化活性及增加癌變風險的標志物，而且能指導臨床治療策略，為我們采用宮腔鏡下去除子宮內(nèi)膜的微創(chuàng)手術(shù)來預防和治療TAM相關(guān)內(nèi)膜病變提供理論依據(jù)，為乳腺癌患者術(shù)后安全服用TAM至全療程，降低復發(fā)率和病死率都有很大的現(xiàn)實意義。

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