產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

黃玉玲，王桂峰，隆小華，*，劉兆普，王 琳，王 博

(1.南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省海洋生物學重點實驗室，江蘇南京 210095;

2.山東省農(nóng)墾科技發(fā)展中心，山東濟南 250014)

產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

黃玉玲1，王桂峰2，隆小華1，*，劉兆普1，王 琳1，王 博1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省海洋生物學重點實驗室，江蘇南京 210095;

2.山東省農(nóng)墾科技發(fā)展中心，山東濟南 250014)

從鹽堿地菊芋根際土壤中篩選出112株產(chǎn)菊粉酶菌株，并從中得到一株酶活較高的真菌A－6，經(jīng)菌落觀察以及采用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR擴增RNA基因序列，測序鑒定結(jié)果為煙曲霉Aspergillus fumigatus。對其產(chǎn)酶條件進行單因素分析結(jié)果顯示，真菌A－6的pH耐受范圍較廣，且具有一定的耐鹽性。經(jīng)正交實驗進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定了A－6的最佳產(chǎn)酶條件為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，30℃，170r/min下振蕩培養(yǎng)3d，酶活最高為13.29U/mL。

篩選，菊粉酶，煙曲霉，產(chǎn)酶條件，優(yōu)化

菊芋(Helianthus tuberosus)又名洋姜，適應(yīng)性廣、耐貧瘠、耐鹽堿。菊芋塊莖中80%為菊粉(Inulin)。菊粉又稱菊糖，是一種果聚糖，由果糖在1分子蔗糖上以β－2，1連接而成，聚合度30左右［1］，分子量3000～5000碳單位。菊粉可水解生成果糖，酸法水解產(chǎn)量較高，但成本高且無機離子含量高。酶法水解具有方法簡便、成本低、產(chǎn)物純度高的優(yōu)點，所以菊粉酶的研究成為熱點［2－3］。八十年代，國外便開始了酶法水解菊粉生產(chǎn)果糖漿的研究，先后開展了菌株篩選、酶學性質(zhì)以及工業(yè)生產(chǎn)固定化技術(shù)等研究［4－5］。我國菊粉酶的相關(guān)研究起步較晚，但大部分工作僅停留在菌株篩選以及酶學研究階段，但由于產(chǎn)酶量和某些作用機制的問題［6］，尚未有成功應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的報道，因此進一步篩選性能優(yōu)良的高產(chǎn)菌株仍然十分必要。菊粉酶(Inulinase)能夠通過外切或內(nèi)切的方式水解菊粉，分別生成低聚果糖或果糖［7］。多種微生物如酵母菌、霉菌和細菌均能合成菊粉酶［8］。國內(nèi)外菊粉酶菌株的研究主要集中在霉菌和酵母兩類真菌，酵母菌中研究最多的是子囊菌亞門的克魯維酵母屬(Kluveromyces)［9－10］。霉菌的研究主要集中在曲霉(Aspergillus)［11－12］、青霉屬(Penicillium)［13］。本研究旨在篩選高產(chǎn)野生產(chǎn)菊粉酶菌株，通過單因子分析和正交實驗，對其進行產(chǎn)酶發(fā)酵條件的摸索與優(yōu)化，為以后酶學性質(zhì)的研究，菊粉酶基因的克隆和工程菌轉(zhuǎn)化等進一步研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

篩菌樣品 采自江蘇大豐、山東東營、黑龍江大慶的菊芋根際土壤;菊芋塊莖 取自江蘇大豐南京農(nóng)業(yè)大學菊芋中試基地;菊芋提取液(EJA) 將粗菊粉與蒸餾水按1∶4比例混勻，80℃熱浸提1h壓濾;菊粉 分子量約5000，購于德國Fluka公司;果糖、3，5二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;其他試劑 均為化學純;初篩培養(yǎng)基(g/L) 菊芋提取液(EJA)70，K2HPO41.0，MgSO4· 7H2O 0.5，NaNO31.5，NH4H2PO42.0，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.1，瓊脂20，pH6;115℃濕熱滅菌30min;復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L) 菊芋提取液120，蛋白胨10，NH4H2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH6; 115℃濕熱滅菌30min;斜面保藏培養(yǎng)基(PDA，g/L)

馬鈴薯200、葡萄糖15、瓊脂20。

1.2 菌株篩選

1.2.1 菌株初篩 稱取一定量的土樣置于含有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃，170r/min搖床振蕩30min，吸取一定量的土壤懸液于初篩培養(yǎng)基，涂布平板并在28℃下培養(yǎng)2～7d，挑取透明圈直徑大的菌落，接種至PDA平板培養(yǎng)基上進行分離純化后，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 復(fù)篩實驗 將初篩得到的菌株，接入裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中。真菌的接種量為直徑0.5cm的菌落，30℃，170r/min搖床培養(yǎng)72h后，用濾紙過濾，棄出菌絲，得到粗酶液。細菌接入量為5%(v∶v)，37℃，170r/min搖床培養(yǎng)24h后，將發(fā)酵液10000r/min離心15min，取上清液即為粗酶液。測定粗酶液酶活，從中選取酶活較高的菌株。

1.3 酶活的測定［14］

取適當稀釋的粗酶液0.2mL與0.8mL 2%菊糖(用0.1mol/L，pH4.6醋酸緩沖液配制)在55℃條件下反應(yīng)20min后，于100℃加熱5min終止酶反應(yīng)，然后取1mL的反應(yīng)液用DNS顯色法［15］測定產(chǎn)物中還原糖的量。在相同的條件下，用100℃滅活的粗酶液作為對照。菊粉酶酶活力定義為pH4.6，55℃下反應(yīng)20min，每分鐘轉(zhuǎn)化成1μmol還原糖的酶量為一個酶活單位。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌落觀察 采用點植孢子懸液的方法，制備一定濃度的孢子懸液，用接種環(huán)或移液槍分別點種在培養(yǎng)基上(重復(fù)5板)，并將此平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)幾天跟蹤觀察菌落特征。

1.4.2 分子生物學鑒定 將平板中培養(yǎng)的菌種轉(zhuǎn)接到裝有50mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，170r/min培養(yǎng)5d后，過濾，取菌絲加液氮充分研磨后，迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，采用OMEGA公司的E.Z.N.ATM.真菌提取試劑盒進行提取基因組DNA。

采用通用引物進行真菌核糖體RNA的PCR擴增:其中ITS rDNA擴增引物為 ITS1和ITS4［16］，ITS1的堿基序列為5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3'，ITS4堿基序5'－TCCTCCGCCTTATTGATATGC－3'［17］。PCR擴增體系為:10×buffer(不含Mg2+)5μL，dNTPs (各2.5mmol/L)4μL，引物各1μL，模板4μL，MgCl2(25mmol/L)2.5μL，Taq酶(2.5U)0.1μL，加ddH2O至50μL。PCR條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s; 50℃退火45s;72℃延伸1min;35個循環(huán);72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖膠電泳檢測后4℃保存待測，測序工作均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 產(chǎn)菊粉酶條件的優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

1.5.1.1碳源對產(chǎn)酶的影響 將菌種接于裝有100mL復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中，分別用20g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、玉米面、菊粉、菊芋提取液作為單一碳源，30℃，170r/min下振蕩培養(yǎng)3d后分別測定酶活，選取最佳碳源。

1.5.1.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 采用上述實驗所得最佳碳源，分別用20g/L的酵母膏、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏和5g/L的NH4H2PO4、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NH3為氮源，培養(yǎng)條件同上測定酶活，選取最佳氮源。

1.5.1.3 無機鹽對產(chǎn)酶的影響 采用上述實驗所得最優(yōu)碳源和氮源，分別采用不同的無機鹽:5g/L的NaCl、KCl、CaCl2，0.1g/L的MgSO4·7H2O、CuSO4· 5H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O，其他條件同上測定酶活，選取最佳無機鹽。

1.5.1.4 pH對產(chǎn)酶的影響 上述各因素確定后，采用不同的初始pH3、4、5、6、7、8、9，培養(yǎng)后測定酶活，確定最佳的初始pH。

1.5.2 正交實驗 根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，確定對酶活影響較大的幾個因素，如表1采用L16(44)正交表對菊芋提取液、酵母膏、NaCl的濃度和pH進行正交實驗，以確定最終的適宜培養(yǎng)條件。

表1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選

經(jīng)菌株初篩，共篩選出可利用菊粉的菌株112株，其中真菌41株，細菌71株，表2列出了酶活最高的10株菌的測定結(jié)果，可以看出雖然細菌在數(shù)量上占有優(yōu)勢，但是真菌的酶活普遍高于細菌，其中真菌A－6的酶活最高為5.30U/mL，因此本研究選取真菌A－6為后續(xù)實驗菌株。

2.2 菌株鑒定

菌落形態(tài)特征:如圖1所示，A－6菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5d，菌落半徑達到3.6～4.7cm，邊緣整齊呈圓形，絲絨狀并產(chǎn)生藍綠色的孢子。

分子鑒定:A－6菌株 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GeneBank中已知菌株序列比對，結(jié)果顯示該菌與煙曲霉屬的同源性均在98%以上。運用ITS序列構(gòu)建最大簡約樹，結(jié)果如圖2所示，分支處的數(shù)值為支持強度，A－6與Aspergillus fumigatus(gi226973986)聚成一支，在所有比對結(jié)果中，A－6與Aspergillus fumigatus(gi226973986)的同源序列相似率最高，故鑒定該菌為煙曲霉屬(Aspergillus fumigatus.)。

2.3 單因素實驗

從圖3可以看出，以菊芋提取液為碳源時，菌株的酶活可達到4.02U/mL，明顯高于其他碳源，而且比高聚合度的純菊粉為碳源時產(chǎn)酶活性高。菊芋提取液中有少量的低聚合度的果糖，可能是Aspergillus fumigatus A－6的產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。

表2 部分菌株的酶活Table 2 Inulinase activity of 10 strains

圖1 菌株A－6的單菌落形態(tài)Fig.1 Shape of individual bacterial colony of strain A－6

圖2 菌株A－6的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A－6

圖3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of different carbon sources on enzyme production

由圖4可以看出，有機氮源中，酵母膏作為氮源時，菌株的酶活最高為6.84U/mL，要高于其他的氮源。無機氮源對菌株產(chǎn)酶影響差異不大，采用NH4H2PO4作為氮源時，菌株酶活最高為2.87U/mL，因其中含有P元素，既可以做氮源又可以做磷源，所以用NH4H2PO4為氮源時Aspergillus fumigatusA－6的酶活要高于其他無機氮源。

如圖5可以看出，采用KCl和NaCl時菌株酶活均為6.32U/mL，Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+對于菌株的酶活起促進作用，相反的 Ca2+和 Cu2+則對Aspergillus fumigatusA－6酶活有著相對的遏制作用。

從圖6可以看出，菌株Aspergillus fumigatusA－6的pH耐受范圍較廣，在pH為3時仍能表現(xiàn)出一定的酶活，其最適pH為5，此時的酶活最高可達到7.7U/mL，隨著pH的升高其酶活逐漸降低，pH為9時酶活仍為3.83U/mL。

圖4 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of different nitrogen sources on enzyme production

圖5 不同無機鹽對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 The effect of different inorganic salt on the production of inulinases

圖6 不同pH對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 The effect of pH on enzyme production

2.4 正交實驗

正交實驗結(jié)果由表3和表4可以看出，各個因素對菌株酶活的影響大小順序依次為:菊芋提取液(EJA)＞pH＞酵母膏(YE)＞NaCl，根據(jù)各個組合酶活力確定出最優(yōu)組合是A3B4C2D1;但是根據(jù)K值，A因素的最佳條件為A4，此時的最優(yōu)組合為A4B4C2D1，此組合未出現(xiàn)在正交實驗中，需要進行實驗驗證，以比較兩個組合的效果，確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

按正交實驗所得的兩組產(chǎn)酶組合，對Aspergillus fumigatusA－6同時進行3批次的產(chǎn)酶培養(yǎng)，測得酶活結(jié)果見表5，可看出最佳產(chǎn)酶組合為A3B4C2D1，該組合培養(yǎng)基組分為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，此時菌株的酶活的平均值為13.27U/mL，實驗結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results and analysis of orthogonal design

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表5 正交實驗驗證Table 5 Verification of orthogonal design

3 結(jié)論

本研究自菊芋鹽堿地種植土壤中篩選得到112株產(chǎn)菊粉酶菌株，并從中得到酶活較高的真菌A－6，分子鑒定結(jié)果顯示該菌為煙曲霉Aspergillus fumigatus，煙曲霉產(chǎn)菊粉酶的研究國內(nèi)報道較少，此研究豐富了產(chǎn)菊粉酶菌株的種類。對產(chǎn)酶條件的單因素實驗顯示碳源菊芋提取物，有機氮源酵母膏和無機氮源NH4H2PO4對于菌株酶活的影響較大，真菌A－6的pH適應(yīng)范圍較廣，為pH5～9。綜合正交實驗的分析結(jié)果，真菌A－6的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，30℃，170r/min下振蕩培養(yǎng)3d，此時酶活測定結(jié)果為13.29U/mL，與單因素實驗時的酶活相比，提高了72%。另外，驗證實驗顯示，正交實驗所得的最佳培養(yǎng)條件下，菌株的酶活相對穩(wěn)定?？梢钥闯鐾ㄟ^正交優(yōu)化，真菌A－6的酶活可得到顯著提高，并且該菌的pH適應(yīng)范圍較寬，具有菌株改良以進一步提高酶活的潛力，本研究豐富了產(chǎn)菊粉酶菌株的品種資源，為產(chǎn)菊粉酶基因的后續(xù)克隆與轉(zhuǎn)化，乃至工業(yè)化應(yīng)用研究提供了理論和實驗基礎(chǔ)。

［1］Erick J V，Dirk G D.Microbiol inulinases fermentation process，properties，and applications［J］.Advances in Applied Microbiology，2004，29:139－176.

［2］王靜，金征宇.微生物菊粉酶的研究進展［J］.生物技術(shù)，2002，12(2):42－44.

［3］王建華.微生物菊粉酶的基因結(jié)構(gòu)、酶學性質(zhì)與應(yīng)用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，13(1):83－89.

［4］UHM Tai Boong.Puification and characterization ofAspergillus ficuumendoinulinase［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2005，63 (1):140－151.

［5］Workman W E，Day D F.Purification and properties of the βfructofuranosidase fromKluyveromyces fragilis［J］.FEBS Letters，1998，160:16－20.

［6］LALOUX O，CASSART JP，DELCOUR J.Cloning and sequencing of the inulinase gene ofKluyveromyces marxianus Var macianusATCC 124［J］.FEBS Letters，2004，289:64－68.

［7］屠用利.菊糖的功能與應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，1997(4): 45－46.

［8］Ongen－Baysal G，Suha SS，Nikolay V.Production and properties of Inulinase fromAspergillus niger［J］.Biotechnol Lett，2004，16(3):275－280.

［9］Wei WL，Zheng ZH，Liu YY.Optimizing the culture conditions for higher inulinase productionKluyveromyces sp.Y－85 and scaling－up fermentation［J］ .Journal of Fermentation and Bioengineering，2008，86(4):395－399.

［10］Kushi Rt，Monti R，Contiero J.Production，purification and characterization of an extravellular inulinase fromKluyveromyc marxianusvar buigaricus［J］.Microbiol Biotechnol，2002，25(2): 63－69.

［11］Poorrna V，Kulkarni PR.A study of inulinase production inAspergillus nigerusing fractional factorial design［J］.Bioresourse Technology，2005，54:315－320.

［12］Qngen－baysal G，Sukan SS.Priduction of inulinase by mixed culture ofAspergillus nigerandKluyveromyees marxinaus［J］.Biotechnology Letters，1996，18(12):1431－1434.

［13］Pessoni RAB，F(xiàn)igueiredo－Ribeiro RCL，Braga MR.Extracellular inulinase frompenicilliumjanczewskii，a fungus isolated from the rhizosphere ofvernonia herbacea［J］.Journal of Applied Microbiology，1999，87:141－147.

［14］王琳，劉兆普，趙耕毛，等.產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30(2):73－77.

［15］北京大學生物系生物化學教研室.生物化學實驗指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，1979:22－24.

［16］INNISMA，GELFAND DH，SNINSKYJ J.PCR protocols:A guide to methods and applications［M］.New York:Academic Press，2000:315－322.

［17］Chen YC，Eisner JD，Kattar MM，et al.Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts［J］.J Clin Microbiol，2001，39(11):4042－4051.

Screening of inulinase production strain and optimization of fermentation condition

HUANG Yu－ling1，WANG Gui－feng2，LONG Xiao－h(huán)ua1，*，LIU Zhao－pu1，WANG Lin1，WANG Bo1
(1.Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.Shandong Province Agricultural Science and Technology Development Center，Ji’nan 250014，China)

112 strains producing inulinase were isolated from rhizosphere soil of Jerusalem artichoke in the saltaffected land.Strain A－6 was obtained and identified asAspergillus fumigatusthrough observing its shape of individual bacterial colony and amplified the rRNA gene sequence using fungal universal primers ITS1 and ITS4.The effect of different factors on its enzyme production shown A－6 had a wide pH range and it could tolerate the high concentration of NaCl.After analysis of orthogonal design，the optimum condition for higher inulinase production of A－6 was determined:EJA 100g/L，YE 25g/L，NaCl 5g/L，NH4H2PO45g/L，pH5，3d of growth under 30℃ and 170r/min in shake cultures.Maximal inulinase activity of A－6 was 13.29U/mL.

screening;inulinase;Aspergillus fumigatus;fermentation condition;optimizing

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0160－04

2012－03－13 *通訊聯(lián)系人

黃玉玲(1986－)，女，碩士，研究方向:菊粉酶菌株與菊芋發(fā)酵。

國家科技支撐項目(2011BAD13B09);江蘇省科技支撐項目(BE2010305和BE2011368);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(200903001－05);中央高?；緲I(yè)務(wù)費項目(Y0201100249);教育部博士點基金(20100097120016)。