長裙竹蓀和棘托竹蓀的抑菌作用及其化學成分研究

羅盛蓮，游 霞，丁聰聰，李 珍，林國秀，于志偉，張 杰

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川成都 610064)

長裙竹蓀和棘托竹蓀的抑菌作用及其化學成分研究

羅盛蓮，游 霞，丁聰聰，李 珍，林國秀，于志偉，張 杰*

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川成都 610064)

對長裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏水溶液采用濾紙片擴散法進行抑菌作用的研究，并應用氣相色譜－質譜聯(lián)用(GC－MS)對其化學成分進行分析。結果表明:長裙竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液對供試細菌表現(xiàn)出明顯抑制作用，但對供試酵母和霉菌抑制作用不明顯;棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液對各供試菌均表現(xiàn)出明顯抑制作用。兩種竹蓀水溶液均對高溫高壓穩(wěn)定。GC－MS分析表明，長裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏水溶液的主要成分是脂肪酸及其酯類、烯烴、鄰苯二甲酸酯類、酚類和酮類。

長裙竹蓀，棘托竹蓀，抑菌作用，化學成分

竹蓀，也稱竹參、竹菌、竹笙，是一類營養(yǎng)豐富的大型野生食用真菌，隸屬于擔子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬。竹蓀作為名貴的食用菌，歷史上列為“宮廷貢品”，近代作為國宴名菜，而且也是醫(yī)學上的新秀，亦是食療佳品，素有“山珍之王”、“菌中皇后”的美稱［1］。我國有紅托竹蓀、黃裙竹蓀、朱紅竹蓀、長裙竹蓀、短裙竹蓀、皺蓋竹蓀和棘托竹蓀7個種［2］。目前用于人工栽培的竹蓀有長裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀和棘托竹蓀。竹蓀在治療高血壓、精神衰弱和腸胃疾病等方面具有顯著效果，而且能防癌抗癌［3］。特別的是，竹蓀還具有特異的防腐功能，在炎熱的夏季做菜煲湯時，置少許竹蓀入內，可防止酸敗，并延長存放時間［4］。據(jù)報道，我國每年由于微生物污染造成的糧食食品腐敗現(xiàn)象十分嚴重，這不僅對人類健康產生威脅，而且造成嚴重的經濟損失。目前用于防止食品腐敗變質的重要手段是添加化學合成防腐劑和天然防腐劑［5］。但是隨著科學技術的進步，人們逐步發(fā)現(xiàn)化學合成食品防腐劑對人體健康存在潛在威脅。因此，開發(fā)更安全、更方便使用的天然防腐劑［6］成為了食品防腐劑發(fā)展的新趨勢。鑒于竹蓀對食物的防腐效果，選取目前種植最廣的長裙竹蓀和棘托竹蓀作為實驗對象，研究其對8種常見的致病致腐菌的抑制作用，并對兩種竹蓀的抑菌成分進行初步分析，為進一步開發(fā)利用竹蓀成為天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀和棘托竹蓀子實體干品 市售，粉碎后過80目篩;乙酸乙酯 分析純，成都科亞公司; R－200旋轉蒸發(fā)儀、島津 2010－plus氣質聯(lián)用儀 BUCHZ公司;大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella coli)、假絲酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黃 曲 霉 (Aspergillusflavus)、青 霉(Penicillium sp.) 四川大學生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室提供;LB培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備 分別取長裙竹蓀和棘托竹蓀干子實體粉末10g，按照料液比1∶10加入乙酸乙酯，混勻后置于水浴中80℃回流抽提8h，過濾，所得濾渣再加入70mL乙酸乙酯，按原條件進行抽提，過濾，棄濾渣，合并兩次濾液，減壓濃縮至恒重?；谥皩嶒?，浸膏選用無菌水溶解，浸膏分別加入10mL無菌水溶解，即得長裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液(以下簡稱提取物)，質量濃度為1g/mL(相當于1mL溶液中含有1g原材料)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌實驗

1.2.2.1 供試菌株懸浮液的制備 將供試菌種接入相應的試管斜面培養(yǎng)基上進行活化。活化之后，用接種環(huán)挑少許菌體于裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管內，細菌置37℃振蕩培養(yǎng)3h，霉菌、酵母菌置25℃振蕩培養(yǎng)3h，制成菌體懸浮液。

1.2.2.2 含菌培養(yǎng)基平板的制備 配制好的PDA固體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后，冷卻至50℃左右。無菌操作下，向干熱滅菌的培養(yǎng)皿中加入200μL菌懸液，再倒入適量的培養(yǎng)基混勻，每皿15～20mL［7］。

1.2.2.3 抑菌實驗 將直徑13mm的小濾紙圓片，于培養(yǎng)皿中160℃干熱滅菌1～2h。將滅菌濾紙片貼在

1.2.2.2中制備好的含菌平板上，再往每個圓片上加入30μL提取物，以無菌水做空白對照，每個平皿放3個圓片。接好的平板于4℃放置4h，再置恒溫箱中培養(yǎng)，細菌于37℃培養(yǎng)18h，霉菌、酵母菌于25℃培養(yǎng)48h，利用十字交叉法［8］測量抑菌圈直徑。

1.2.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定 利用LB培養(yǎng)基和竹蓀提取物，經試管連續(xù)雙倍稀釋法得竹蓀提取物質量濃度分別為 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625g/mL的培養(yǎng)基各10mL，另設不加提取液的培養(yǎng)基為空白對照，121℃滅菌15min。趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻后在每一濃度培養(yǎng)基上劃線接種供試菌，每個濃度三個平行。細菌置37℃下培養(yǎng)18h，真菌置25℃下培養(yǎng)48h，觀察生長情況，以平板中沒有菌體生長的最低濃度即為提取物的最低抑菌濃度MIC。

1.2.2.5 穩(wěn)定性研究 將長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物在121℃下高壓滅菌15min，以枯草芽孢桿菌、假絲酵母和黃曲霉為代表，按照1.2.2.3方法測定抑菌圈，以未處理的提取物為對照。

1.2.3 化學成分的分離與鑒定

1.2.3.1 氣相色譜條件 色譜柱:FFAP極性柱(30m ×0.32mm×0.25μm);進樣口溫度為250℃，檢測器溫度 280℃;采用程序升溫:70℃保持 3min，以5℃/min升至 100℃，保持 6min，以 5℃/min升至150℃，保持 6min，以 7℃/min升至 220℃，保持15min;柱流量 2.0mL/min，柱頭壓 5.5Psi，進樣量0.5μL;分流比30∶1。

1.2.3.2 質譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電子能量70Ev;溶劑延遲時間6min;分子量范圍50～450amu。

2 結果與分析

2.1 提取物的抑菌效果

長裙竹蓀乙酸乙酯浸膏為淺黃色油狀粘稠液體。由表1知，長裙竹蓀提取物對兩類革蘭氏細菌均有明顯抑制作用，而且革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)比革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和沙門氏菌)更敏感;但對酵母和霉菌無明顯抑制作用。

棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏為深黃色油狀粘稠液體。由表1知，棘托竹蓀提取物對各種供試細菌、真菌均有不同程度的抑制作用，其中酵母更敏感。

表1 長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的抑菌實驗結果Table 1 Antimicrobial activities of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

從表2知，長裙竹蓀提取物對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌的MIC為0.05g/mL，對枯草芽孢桿菌的MIC為0.025g/mL，對大腸桿菌的MIC為0.1g/mL。抑菌結果顯示長裙竹蓀提取物對真菌無明顯抑制作用，故不討論其對真菌的MIC。

棘托竹蓀提取物對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、假絲酵母、黃曲霉、桔青霉的MIC為0.05g/mL，對大腸桿菌的MIC為0.1g/mL。

2.2 穩(wěn)定性分析

由表3知，經高溫高壓處理后，長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對枯草芽孢桿菌、假絲酵母和黃曲霉的抑制效果變化不大，表明兩種提取物中的有效成分對高溫、高壓穩(wěn)定，故而由此獲得的防腐劑性質穩(wěn)定。

2.3 提取物的化學成分鑒定

實驗對兩種竹蓀的抑菌成分進行了初步分析。

通過GC－MS技術分離和鑒定，長裙竹蓀提取物共鑒定出37種化學成分(表4)，占提取物總量的82.98%，主要是脂肪酸酯類 (41.27%)、烯烴(14.68%)、酮類(12.56%)、醛類(5.78%)、鄰苯二甲酸酯類(4.37%)、醇類(1.26%)、酚類(1.23%)、烷烴(1.01%)和酰胺類(0.82%)等。其中(－)－異長葉烯－9－酮(10.73%)、苯乙醛(3.56%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(2.59%)、棕櫚酸甲酯(4.88%)、2－氧－棕櫚酸甲酯(2.71%)、油酸甲酯(19.66%)、亞油酸甲酯(3.11%)和Z－9－十六烷基花生酸酯(4.26%)是主要成分。

表2 長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對各種受試菌的MIC測定結果Table 2 MICs of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

表3 長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的穩(wěn)定性分析Table 3 Stability analysis of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

通過GC－MS技術分離和鑒定，棘托竹蓀提取物共鑒定出21種化學成分(表4)，占提取物總量的84.83%，主要是脂肪酸及其酯類(25.85%)、鄰苯二甲酸酯類(19.01%)、酚類(18.18%)、酮類(8.67%)、烯烴(5.62%)、醛類(3.11%)、有機酸類(2.26%)、烷烴(1.16%)和醇類(0.97%)等。其中氧雜環(huán)十三烷－2－酮(6.02%)、(－)－異長葉烯－9－酮(2.65%)、苯乙醛(3.11%)、α－芹子烯(4.44%)、2，6－二甲基對苯二酚(18.18%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(14.12%)、鄰苯二甲酸二丁酯(4.89%)、7，10－十八碳二烯酸甲酯(4.49%)、棕櫚酸甲酯(8.34%)、油酸甲酯(6.17%)、硬脂酸甲酯(2.18%)、2－羧甲基－3－甲基－環(huán)戊甲酸(1.19%)和葵二酸(1.07%)是主要成分。

上述結果表明，相同濃度的長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物有11種相同成分，主要是酯類、酮類、酚類和醛類化合物。經大量實驗證明，各種酚類、脂肪酸酯類化合物均對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用［9］，這可能是兩種提取物在抑制細菌方面表現(xiàn)出一致性的主要原因。而各成分的含量差異較大，酚類、鄰苯二甲酸酯類在棘托竹蓀提取物中的含量分別為18.18%、19.01%，遠高于在長裙竹蓀提取物中的含量(分別為1.23%、4.37%)，可能引起兩者在抑制真菌活性方面產生差異。據(jù)報道，酚類物質的抑菌作用不僅限于細菌，對于酵母和霉菌也有效果［10］。陳敏［11］對鏈霉菌6803菌株產生的化感物質進行抑菌研究，結果表明鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯能有效抑制荔枝炭疽病和小麥赤霉病。其中哪些成分抑菌效果較好，是否具有協(xié)同、加成或拮抗作用，還有待于進一步研究。

3 結論

如今尚未有比較長裙竹蓀和棘托竹蓀抑菌作用及其化學成分的報道，本實驗對兩種竹蓀進行了對比研究，結果表明長裙竹蓀提取物對細菌抑制效果明顯，對酵母菌和霉菌基本無抑制作用，與譚敬軍等［12］實驗結果一致。棘托竹蓀提取物對三類受試菌均有不同程度的抑菌作用，與檀東飛等［13］實驗結果一致。MIC測定結果表明，長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌的MIC均為0.05g/mL，對大腸桿菌的MIC均為0.1g/mL，而長裙竹蓀提取物對枯草芽孢桿菌的MIC為0.025g/mL，棘托竹蓀提取物對枯草芽孢桿菌、假絲酵母、黃曲霉、桔青霉的MIC為0.05g/mL。穩(wěn)定性分析表明兩種竹蓀提取物都能耐高溫高壓，可應用于食品中。通過GC－MS分析，長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的主要成分均為酯類、酮類、酚類和醛類化合物，可能是兩種提取物對供試細菌產生明顯抑制作用的原因，而棘托竹蓀提取物中酚類和鄰苯二甲酸酯類的含量遠高于長裙竹蓀提取物，可能是酵母和霉菌對棘托竹蓀提取物更敏感的原因。

上述實驗結果表明，長裙竹蓀和棘托竹蓀均含有天然抑菌成分，但由于竹蓀提取物中成分比較復雜，需要對其子實體的抑菌成分和抑菌機理進行進一步分析，為新型防腐劑的研究開發(fā)開辟一條新的道路。

表4 長裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的GC－MS分析Table 4 Results of GC－MS analysis

［1］韓慧，張剛，郝景雯，等.長裙竹蓀抑菌作用研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(5):129－131.

［2］暴增海，馬桂珍.我國的竹蓀資源及其開發(fā)利用［J］.資源科學，1994(3):68－71.

［3］丁湖廣，丁榮輝.真菌皇后竹蓀制種與栽培新技術［M］.北京:農業(yè)出版社，1992:20－21.

［4］郝景雯，張剛，韓慧.長裙竹蓀乙醇提取工藝及抑菌作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(10):123－124.

［5］王麗，劉毓，陳翠嵐.我國食品防腐劑的應用及發(fā)展趨勢［J］.食品安全質量檢測學報，2011，2(2):83－87.

［6］吳京平.新型植物源天然食品防腐劑及其抑菌性能［J］.中國食品添加劑，2009(3):61－64.

［7］沈萍，范秀容，李光武.微生物學實驗［M］.北京:高等教育出版社，2006:94.

［8］陳利軍，胡孔峰，史洪中.一株木霉菌揮發(fā)性物質的抑菌活性及成分分析［J］.生物技術，2010，20(4):78－79.

［9］萬素英，李琳，王慧君.食品防腐與食品防腐劑［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1997:42－46.

［10］郝利平，聶乾忠，陳永泉，等.食品添加劑［M］.北京:中國農業(yè)大學出版社，2009:57－60.

［11］陳敏.鏈霉菌6803的化感作用及其化感物質的分離與鑒定［D］.廣東:華南農業(yè)大學，2007.

［12］譚敬軍.竹蓀抑菌特性研究［J］.食品科學，2001，22(9): 73－75.

［13］檀東飛，蘇燕卿，吳若菁，等.棘托竹蓀乙酸乙酯提取物的抑菌作用研究［J］.海峽藥學，2002，14(5):101－103.

Antimicrobial activities and chemical compositions of Dictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvata

LUO Sheng－lian，YOU Xia，DING Cong－cong，LI Zhen，LIN Guo－xiu，YU Zhi－wei，ZHANG Jie*
(Key Laboratory of Bio－resource and Ecological Environment，Ministry of Education，Life Science College of Sichuan University，Chengdu 610064，China)

Antimicrobial activities and chemical compositions of water extracts of ethyl acetate extracts ofDictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvatawere studied.The filtering paper method was applied to the antimicrobial activity test.The chemical compositions of the extracts had been researched by Gas Chromatography－Mass Spectrometry(GC－MS).The results showed that the extract ofDictyophora indusia fisscherhad strong antimicrobial effects on bacteria but weak on yeast and mold.The extract ofDictyophora echinovolvatahad strong antimicrobial activity to mold，yeast and bacteria tested.Meanwhile，the antimicrobial activities under high temperature and strong pressure were stable.GC－MS analysis indicated that the major compositions of the extracts were fatty acids，olefins，phthalates，phenols and ketones.

Dictyophora indusia fisscher;Dictyophora echinovolvata;antimicrobial activity;chemical composition

TS202.3

A

1002－0306(2012)21－0070－04

2012－04－12 *通訊聯(lián)系人

羅盛蓮(1988－)，女，碩士研究生在讀，研究方向:食品研究與開發(fā)。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2007AA021506)。