雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌生長影響的研究

趙 爽，劉少偉，*，陳如琪，呂寶龍，盧艷花，費(fèi) 楠

(1.華東理工大學(xué)，上海200237;2.上海英聯(lián)食品飲料有限公司，上海 200245)

雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌生長影響的研究

趙 爽1，劉少偉1，*，陳如琪1，呂寶龍1，盧艷花1，費(fèi) 楠2

(1.華東理工大學(xué)，上海200237;2.上海英聯(lián)食品飲料有限公司，上海 200245)

主要研究雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌生長過程的影響。通過在營養(yǎng)成分缺省的培養(yǎng)基中添加雙麥麥精，采用分光光度法測(cè)定菌液吸光值(OD600)，根據(jù)OD值確定對(duì)應(yīng)的嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)，從而分析雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌生長情況的影響。利用正交實(shí)驗(yàn)，通過直接計(jì)數(shù)法確定雙麥麥精與其他營養(yǎng)成分的最佳比例。結(jié)果表明，雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌的生長有明顯的促進(jìn)作用，可為嗜熱鏈球菌提供充足的碳源和生長因子。雙麥麥精的添加量為16g/L時(shí)效果最佳。分析比較吸光值法和直接計(jì)數(shù)法測(cè)得的生長曲線，結(jié)果表明兩種方法具有良好的相似性，其中在對(duì)數(shù)期有強(qiáng)相關(guān)性。

嗜熱鏈球菌，生長曲線，雙麥麥精，缺省培養(yǎng)基，菌落計(jì)數(shù)

近十年來，隨著健康意識(shí)的增強(qiáng)和人民生活水平的提高，我國發(fā)酵乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展［1］。發(fā)酵乳制品中的乳酸菌具有良好的保健作用，產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值較高，并能改善腸道正常微生物區(qū)系的穩(wěn)定性［2］。乳酸菌數(shù)量是評(píng)價(jià)該類產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值與保健作用的重要依據(jù)［3－5］。嗜熱鏈球菌作為一種對(duì)人體有明顯食療作用的有益菌，是生產(chǎn)酸奶的重要微生物菌群［6］。以大麥為原料制備的麥精和麥芽汁作為培養(yǎng)基原料已有廣泛的應(yīng)用［7－9］。雙麥麥精是以大麥，其他麥類為原料通過酶解提取的一種天然營養(yǎng)物質(zhì)。前期研究表明，在酸奶制作過程中添加雙麥麥精，對(duì)酸奶中保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌以及雙歧桿菌的生長有明顯的促進(jìn)作用，并且在其儲(chǔ)存階段起到一定的保護(hù)作用［10］。在Domiati奶酪中添加麥精可以促進(jìn)奶酪的香味，使奶酪有更好的蛋白水解和脂肪分解并具有更高的菌體含量［11］。麥精具有抗氧化性［12］，其具有多種功能性成分，β－葡聚糖就是研究較多的一種益生元，此外還有低聚糖、生育三烯酚、γ－氨基丁酸等［13］。現(xiàn)已證明低聚糖對(duì)人體健康具有重要作用，并對(duì)提高乳酸菌活菌數(shù)具有促進(jìn)作用［14－15］，能增強(qiáng)乳酸菌的抗冷凍性和抗膽汁能力［16－17］。本文在前期工作的基礎(chǔ)上，用含有雙麥麥精的培養(yǎng)基和培養(yǎng)液對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌生長的影響，探討雙麥麥精作用于嗜熱鏈球菌的意義。并分析分光光度法和直接計(jì)數(shù)法兩種嗜熱鏈球菌生長曲線測(cè)定方法的差異，分析其相關(guān)性，根據(jù)所得結(jié)果可對(duì)嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)過程進(jìn)行指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌 YO－MIXTM499(Streptococcus thermophillus) 華東理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品系實(shí)驗(yàn)室提供;雙麥麥精 上海英聯(lián)食品飲料有限公司提供，雙麥麥精主要成分為蛋白質(zhì)7%，還原糖28%;M17培養(yǎng)基(g/L) 酵母膏2.5，蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，乳糖5.0，抗壞血酸0.5，磷酸氫二鉀5.0，硫酸鎂0.5，甘油10.0，調(diào)pH至7.0～7.2。

超凈工作臺(tái)SW－CJ－2FDA 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP－9052 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌器SYQ－DSX－280B

上海申安醫(yī)療器械廠;pH計(jì)FE20型 梅特勒－托利多公司;紫外可見分光光度計(jì)UV－2000 尤尼柯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 保存的菌種活力不旺盛，處于維持生命的休眠狀態(tài)，因而在使用前要進(jìn)行活化。嗜熱鏈球菌活化方法:將4℃冰箱中保存的嗜熱鏈球菌菌種以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的接種量接入滅菌牛奶中，按照嗜熱鏈球菌的生長最適溫度，放入42℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待凝乳后取出，放在冰箱中保存，每7d活化一次，活化三代。

1.2.2 缺省培養(yǎng)基配制 以M17為基本培養(yǎng)基，根據(jù)雙麥麥精為嗜熱鏈球提供不同營養(yǎng)成分(碳源、氮源、生長因子)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，見表1。

表1 培養(yǎng)基的配制Table 1 Preparation of medium

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將活化過的菌種按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%接種量加入到M17培養(yǎng)基和缺省培養(yǎng)基中，放入42℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行OD600值和活菌數(shù)的測(cè)定。

1.2.4 菌液吸光值(OD600)的測(cè)定 搖床培養(yǎng)溫度為42℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，使用分光光度計(jì)，在600nm條件下通過比色法測(cè)定菌液的吸光值，從0h開始，每2h測(cè)定一次，測(cè)定12次。用未接種的培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后作空白。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，3次平行實(shí)驗(yàn)，求平均值，繪制生長曲線。

1.2.5 活菌落計(jì)數(shù)方法 采用逐級(jí)稀釋倒平板及涂布法兩種。取菌液1mL，用滅菌蒸餾水依次稀釋10、102、103、104、105倍，選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間進(jìn)行計(jì)數(shù)，取菌液0.1mL分別滴于不同培養(yǎng)基上，42℃培養(yǎng)72h。72h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，相同培養(yǎng)基上的菌落數(shù)以平均值為準(zhǔn)記數(shù)。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn) 為了確定雙麥麥精與其他營養(yǎng)成分的最佳比例，在缺省成分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以由正交實(shí)驗(yàn)碳源濃度(A)、氮源濃度(B)、雙麥麥精濃度(C)三個(gè)因素，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 L9(34)orthogonal experimental level table

1.3 分析方法

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Excel進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌在缺省培養(yǎng)基中的生長曲線比較

2.1.1 同時(shí)缺省碳源和氮源的生長情況 由圖1可知，嗜熱鏈球菌在缺省碳源和氮源的A、B培養(yǎng)基的前0～10h，長期處于生長的調(diào)整期，前8h與M17培養(yǎng)基生長情況類似，之后生長緩慢。與M17培養(yǎng)基的生長曲線相比，調(diào)整期延長了4h。培養(yǎng)終點(diǎn)24h，A、B培養(yǎng)基下的OD600值僅為M17的一半，說明雙麥麥精不能為嗜熱鏈球菌生長提供充足的碳源和氮源，嗜熱鏈球菌不能僅靠雙麥麥精進(jìn)行大量增殖。A、B培養(yǎng)基的生長曲線差異不顯著(p＞0.05)，雙麥麥精在這種環(huán)境下，完全可以作為嗜熱鏈球菌的生長因子，達(dá)到和原生長因子(抗壞血酸、硫酸鎂、甘油、磷酸氫二鉀)同樣的效果。

圖1 缺省碳源和氮源的嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.1 Lack of source of carbon and nitrogen source of streptococcus thermophilus cultured growth curve

2.1.2 缺省碳源的生長情況 由圖2可知，嗜熱鏈球菌在缺省碳源的C、D培養(yǎng)基中的生長情況與M17中類似，在處于調(diào)整期的0～8h生長情況基本一致。從對(duì)數(shù)期開始，C、D的OD600值略高于M17的培養(yǎng)基，但C、D培養(yǎng)基的嗜熱鏈球菌比M17的稍晚進(jìn)入對(duì)數(shù)期。說明雙麥麥精可以為嗜熱鏈球菌提供充足的碳源，并且效果略優(yōu)于M17培養(yǎng)基中的碳源成分(乳糖)。但在雙麥麥精作為單一碳源的情況下，進(jìn)入對(duì)數(shù)期較慢，可能由于嗜熱鏈球菌分解乳糖的速度快于分解麥芽糖，因而乳糖更容易被嗜熱鏈球菌吸收利用，而在對(duì)于雙麥麥精中麥芽糖的吸收利用，需要更多的時(shí)間。此條件下，C、D生長曲線差異不顯著(p＞0.05)，說明在此條件下，雙麥麥精可以提供嗜熱鏈球菌生長需要的生長因子。

圖2 缺省碳源的嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.2 Lack of carbon source streptococcus thermophilus cultured growth curve

2.1.3 缺省氮源的生長情況 由圖3可知，嗜熱鏈球菌在缺省氮源的E、F培養(yǎng)基中的處于調(diào)整期的時(shí)間較短，比M17中的嗜熱鏈球菌提早2h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，也明顯早于C、D培養(yǎng)基。在6～8h的對(duì)數(shù)期，雙麥麥精可提供一定量的嗜熱鏈球菌生長所需的氮源，但在8～16h，隨著嗜熱鏈球菌數(shù)量的增長，氮源的需求不能得到滿足，相對(duì)不足，造成了對(duì)數(shù)期整體時(shí)間短，增長速率慢的結(jié)果。最終在穩(wěn)定期的OD600值遠(yuǎn)小于M17培養(yǎng)基，說明雙麥麥精在作為嗜熱鏈球菌氮源的能力比較有限，如果要通過雙麥麥精獲得足夠的氮源，還需要增加雙麥麥精的添加量。在此條件下，雙麥麥精仍可以提供嗜熱鏈球菌生長需要的生長因子，最終限制嗜熱鏈球菌生長的原因是氮源不足。

圖3 缺省氮源的嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.3 Lack of nitrogen sourcestreptococcus thermophilus cultured growth curve

2.1.4 缺省生長因子的生長情況 由圖4可知，嗜熱鏈球菌在缺省生長因子的G培養(yǎng)基中可以快速增殖，在穩(wěn)定期內(nèi)的OD600值大于M17培養(yǎng)基，但略微少于無缺省培養(yǎng)基H。說明一方面，雙麥麥精能為嗜熱鏈球菌提供原M17培養(yǎng)基中沒有的生長因子，對(duì)嗜熱鏈球菌的生長產(chǎn)生了積極作用。另一方面雙麥麥精也能為嗜熱鏈球菌提供部分的碳源和氮源，保證了嗜熱鏈球菌生長在營養(yǎng)充足的環(huán)境中。H培養(yǎng)基達(dá)到最高菌數(shù)的時(shí)間比M17培養(yǎng)基大約提前了4h，在穩(wěn)定期的OD600值也是所有培養(yǎng)基中最高的。說明在提供雙麥麥精使其所有營養(yǎng)條件充足的情況下，可以有效的縮短嗜熱鏈球菌調(diào)整期和對(duì)數(shù)期的時(shí)間，使其提前到達(dá)穩(wěn)定期。

圖4 缺省生長因子的嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.4 Lack of growth factor Streptococcus thermophilus cultured growth curve

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(表3)表明:最終成分優(yōu)化的結(jié)果為A2B3C3，即乳糖濃度5g/L，酵母膏濃度4g/L，蛋白胨濃度12g/L，牛肉膏濃度7g/L，雙麥麥精濃度16g/L。在此條件下，測(cè)得嗜熱鏈球菌活菌數(shù)為35.9 ×107cfu/mL。同時(shí)通過比較各項(xiàng)指標(biāo)的極差R值，可以得到各因素的主次關(guān)系為B＞A＞C。

表3 培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results

作為對(duì)照的 M17培養(yǎng)基的活菌數(shù)為3.03× 108cfu/mL。如果培養(yǎng)基雙麥麥精濃度較低，則培養(yǎng)基營養(yǎng)相對(duì)不足，嗜熱鏈球菌的生長就會(huì)受到一定的限制。如果培養(yǎng)基雙麥麥精濃度過高，不僅不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增長，反而會(huì)抑制菌體增殖，因?yàn)闈舛冗^高，造成整個(gè)培養(yǎng)基的濃度過大，產(chǎn)生細(xì)胞滲透現(xiàn)象，造成嗜熱鏈球菌失水皺縮，導(dǎo)致生長受到影響。不同雙麥麥精添加量的菌落均為乳白色，光滑，邊緣整齊，直徑約2mm，菌落較厚，無明顯差異。

2.3 生長曲線比較

2.3.1 分光光度法和直接計(jì)數(shù)法整體比較 嗜熱鏈球菌在適宜生長條件下菌體細(xì)胞生長出現(xiàn)4個(gè)階段:調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。生長曲線反映了嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)過程中的繁殖規(guī)律，同一嗜熱鏈球菌在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線不同，不同測(cè)定方法測(cè)得的生長曲線也不同。目前，主要采用分光光度法和直接計(jì)數(shù)法測(cè)定生長曲線。前者所測(cè)為包含已死亡菌體和因菌體自溶產(chǎn)生的吸光值，并且據(jù)朗伯—比爾定律，各類低濃度溶液吸光值定量測(cè)定的依據(jù)，濃度過高或過低均影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。后者所測(cè)為實(shí)際觀察并計(jì)數(shù)得到的菌體細(xì)胞數(shù)量。用分光光度法和直接計(jì)數(shù)法分別測(cè)定M17培養(yǎng)基雙麥麥精添加量為9.36g時(shí)，嗜熱鏈球菌不同生長時(shí)間培養(yǎng)液的OD600值和菌體數(shù)量，繪制其生長曲線，并對(duì)2種測(cè)定方法所繪制的生長曲線進(jìn)行比較，分析差異，見圖5。

圖5 嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.5 Growth curve of streptococcus thermophilus

兩條曲線通過相關(guān)系數(shù)分析，相似度比較高，相似度系數(shù)為0.977。說明嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600值的吸光度與直接計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量呈強(qiáng)相關(guān)性。分光光度法和直接計(jì)數(shù)法測(cè)定的生長曲線在對(duì)數(shù)期以前基本一致。在對(duì)數(shù)期，直接計(jì)數(shù)法所得生長曲線整體高于分光光度法所得生長曲線，可能由于菌體繁殖比較旺盛，使得菌體在培養(yǎng)基中成活率較高。穩(wěn)定期分光光度法高于直接計(jì)數(shù)法，可能由于穩(wěn)定期內(nèi)菌體的自溶速度小于其緩慢的增長速度，同時(shí)隨著代謝產(chǎn)物增多，使吸光度略微偏高。

2.3.2 嗜熱鏈球菌在對(duì)數(shù)期的OD600值與直接計(jì)數(shù)法測(cè)得嗜熱鏈球菌的關(guān)系 以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，直接計(jì)數(shù)法測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制XY散點(diǎn)圖，利用最小二乘法繪出兩者的回歸曲線，結(jié)果見圖6?；貧w方程為y=－11.489x2+35.968x+6.1745(R2= 0.9998)，回歸方程具有極顯著意義。

圖6 對(duì)數(shù)生長期OD值與直接計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系Fig.6 Relationship in logarithic growth phase between thr OD value and the number of cells calculated by direct counting method

3 結(jié)論與討論

雙麥麥精對(duì)嗜熱鏈球菌的生長有明顯的促進(jìn)作用，可以為嗜熱鏈球菌提供生長所需要的碳源和生長因子，但不能提供嗜熱鏈球菌生長所需要的全部氮源，只能提供部分氮源。必須加入酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)作為嗜熱鏈球菌生長所需的氮源，這些物質(zhì)中含有大量的氨基酸、肽類等可溶性含氮化合物、維生素和無機(jī)鹽。這與萬紅兵等［18］的研究結(jié)果一致。嗜熱鏈球菌可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、果糖作為碳源［19－20］。通過雙麥麥精的添加，和乳糖同時(shí)存在，形成復(fù)合碳源，可以促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長，可以使嗜熱鏈球菌能快速通過調(diào)整期和對(duì)數(shù)期，提早進(jìn)入對(duì)數(shù)期，從而縮短整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間。在有充足氮源的環(huán)境下，添加雙麥麥精，可以明顯的增加穩(wěn)定期的最大菌數(shù)。

最終成分優(yōu)化的結(jié)果為乳糖濃度5g/L，酵母膏濃度4g/L，蛋白胨濃度12g/L，牛肉膏濃度7g/L，雙麥麥精濃度16g/L。為雙麥麥精在M17培養(yǎng)基中的應(yīng)用提供重要的依據(jù)。

用分光光度法和直接計(jì)數(shù)法分別繪制的嗜熱鏈球菌生長曲線相似度較高。在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的情況下，在對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液的OD600值與實(shí)際菌體細(xì)胞數(shù)有強(qiáng)相關(guān)性，在對(duì)數(shù)生長期可通過測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值計(jì)算實(shí)際嗜熱鏈球菌活菌數(shù)，也可以根據(jù)培養(yǎng)液的OD600值判斷菌體生長是否進(jìn)入對(duì)數(shù)期。

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Effect of ABF Bio+malt extract on the growth ofStreptococcus thermophilus

ZHAO Shuang1，LIU Shao－wei1，*，CHEN Ru－qi1，LV Bao－long1，LU Yan－h(huán)ua1，F(xiàn)EI Nan2
(1.East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China; 2.Shanghai AB Food＆Beverages Ltd.，Shanghai 200245，China)

The effects of ABF Bio+malt extract on the main nutrition constituent of theStreptococcus thermophilesin its growth progress by adding ABF Bio+malt in the incomplete nutrient medium were studied.The number of viable cells inStreptococcus thermophilescounted according to its Bacilli absorbance was used to analyse the effect onStreptococcus thermophilesbrought by ABF Bio+malt extract.The optimal proportion of ABF Bio+malt extract and other nutrients was determined by orthogonal experiment with direct counting method.The results showed that ABF Bio+malt extract played an important role of the augmentor the growth ofstreptococcus thermophilusas well as a provider of sufficient carbon source and growth factors for it.The ABF Bio+malt extract produced the best result when its additive amount reached 16g/L.After analysis and comparison of the growth curves which were measured by absorb value method and the direct counting method respectively，the curves were proved to be of good similarity，especially in the logarithmic phase.

Streptococcus thermophilus;growth curve;ABF Bio+malt extract;default medium;colony counts

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0062－05

2012－04－10 *通訊聯(lián)系人

趙爽(1990－)，男，本科，研究方向:食品科學(xué)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金;上?？莆Y助課題(10dz1200904)。