生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的研究

呂傳萍，李學(xué)英，楊憲時，*，郭全友

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的研究

呂傳萍1，2，李學(xué)英1，楊憲時1，*，郭全友1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

含氟量高是制約南極磷蝦食品開發(fā)的一個重要因素，利用生石灰降低南極磷蝦酶解液中的氟含量、成本低、效果好、無殘留，可為南極磷蝦商業(yè)化食品開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。吸附反應(yīng)有多種類型，分析XRD圖譜可知生石灰與南極磷蝦酶解液中氟的吸附反應(yīng)是離子反應(yīng)。以降氟率為指標，生石灰添加量(X1)、初始pH(X2)、時間(X3)和溫度為考察因素，對生石灰降低酶解液中氟含量進行了單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，建立了二次響應(yīng)面回歸模型Y=84.49+ 4.29X1+2.77X2+0.18X3－0.93X1X2－1.09X2X3－2.11X21－0.55X22+0.81X23。在此基礎(chǔ)上結(jié)合實際生產(chǎn)確定降氟最優(yōu)條件為生石灰添加量0.009685g/mL，pH11.50，時間45min，溫度(25±2)℃，此條件下降氟率達到88.25% ±1.43%(p＜0.05)。降氟后，水解液中TCA－NSI降低了2.55%，DH降低了7.85%，說明生石灰對酶解液營養(yǎng)影響較小。反應(yīng)后體系通過0.40μm濾膜除去Ca(OH)2和CaF2，實現(xiàn)降氟材料的無殘留。

南極磷蝦，降氟，生石灰，響應(yīng)面

南極磷蝦資源豐富，據(jù)估計最高有數(shù)億噸，開發(fā)和利用潛力巨大。南極磷蝦營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素等含量高。其肌肉鮮樣中含粗蛋白16.31%，必需氨基酸指數(shù)(EAAI)為54.94［1］，含量滿足FAO/WHO/UNU1985推薦的成年人對蛋白的攝入要求［2］;粗脂肪含量為1.30%，不飽和脂肪(UFA)占67.6%［3］;必需營養(yǎng)微量元素鐵、錳、鋅、銅的比例正常，且含硒量很高，是生物界硒的重要來源［1］。因此，南極磷蝦應(yīng)該作為人類的食品新資源來開發(fā)應(yīng)用。目前世界各國的科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)出部分南極磷蝦產(chǎn)品，如“奧肯”蛋白塊、蝦糕以及南極磷蝦香腸餡等;部分研究人員還從南極磷蝦中提取具有功能性的蝦油［4］及抗心血管疾病的功能性肽［5］;還有研究將南極磷蝦在生物酶的作用下酶解，制得高氨基酸和短肽含量的酶解液。南極磷蝦體內(nèi)含有大量的氟，德國科學(xué)家Soevik等人測得冰凍貯存的整體磷蝦氟含量約為2400mg/kg。張海生等認為活著的磷蝦中氟富集是一個主動吸收的過程。南極磷蝦死后，甲殼中的氟會慢慢轉(zhuǎn)移至肌肉中［6］。適量的氟有利于人類骨骼和牙齒的生長，但攝入過量會導(dǎo)致骨骼畸形［7］。根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會推薦，成年人每天應(yīng)攝取氟1.5～3mg，由此可見南極磷蝦體內(nèi)的氟遠超人體的適應(yīng)范圍，氟含量過高的南極磷蝦食品會影響人體健康。因此，為實現(xiàn)南極磷蝦產(chǎn)品的可食用化，必須降低產(chǎn)品中的氟含量。目前降低溶液中氟含量的方法有很多，主要有化學(xué)沉淀法［8］、離子交換法［9］、濾膜法［10］、電解法［19］及吸附法［11］。在這些方法中，具有高效性和易操作性的吸附法最常用，現(xiàn)已開發(fā)出不同種類的吸附劑，例如活性氧化鋁、骨碳、合成離子交換材料等［12］。吸附反應(yīng)過程是指氟離子通過界面層的離子交換或表面化學(xué)反應(yīng)［13］。但是很多降氟方法和工具都價格不菲或操作不便，且南極磷蝦酶解液中含有大量營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，降低氟含量的同時要求不能影響原有酶解液的營養(yǎng)功能，因此選擇經(jīng)濟方便且降氟效率高的降氟方法很重要。生石灰價格便宜且降氟能力較好［14］，降氟過程不會降低酶解液的營養(yǎng)價值，因此是一種理想的降氟方法。目前使用生石灰降低南極磷蝦酶解液中的氟含量的方法尚未見報道，本研究以南極磷蝦酶解液為原料，通過單因素實驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化降氟工藝，最終得到營養(yǎng)幾乎未受損失的低氟量酶解液，為低氟化南極磷蝦食品商業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 我國“南極海洋生物資源開發(fā)利用項目組”于2010年1月南極FAO 48.1區(qū)捕撈，2010年4月冷凍條件運抵實驗室，在－28℃條件下貯藏備用;Alcalase酶 實測酶活力109387U/g，Novozyme (中國)生物技術(shù)有限公司;生石灰、硫酸銅、硫酸鉀、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸等 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為國產(chǎn)分析純。

x’Pert PRO型X射線衍射儀 荷蘭P Analytical公司;BioTek 213751型微孔板掃描分光光度計 美國Bio－Tek公司;CF 16XII型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;KIELETEC ANALYSISER全自動凱氏定氮儀 瑞典Foss公司;電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;85－2型恒溫磁力攪拌器

上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;FA1004A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司;testo 230型pH/溫度測量儀 德圖儀器上海有限公司;DS－1型組織搗碎機 上海精科實業(yè)有限公司;ZHWY－200H型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智成科學(xué)儀器有限公司。

1.2 測定方法

1.2.1 酶活力的測定 改進的Folin－酚法［15］。

1.2.2 氟含量的測定方法 按GB/T5009.18－2003食品中氟的測定中氟離子選擇電極法進行。

1.2.3 總氮測定 按GB/T5009.5－2003食品中蛋白質(zhì)的測定中凱氏定氮法進行。

1.2.4 短肽得率測定 三氯乙酸可溶性氮法［16］。

1.2.5 氨基態(tài)氮的測定 甲醛電位滴定法［17］。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解液的制備 由正交旋轉(zhuǎn)組合實驗優(yōu)化得到A lcalase酶水解南極磷蝦的工藝為:酶解溫度50.7℃，酶解時間239m in，加酶量3010U/g，pH8.01，固液比為南極磷蝦∶蒸餾水=1∶3［18］。

1.3.2 生石灰的制備 生石灰于研缽中磨碎，過120目標準篩，實驗前將生石灰置于90～105℃下烘干4h，于干燥器中儲存。

1.3.3 反應(yīng)機理的分析 用X射線粉末衍射儀分析生石灰與南極磷蝦酶解液反應(yīng)前后的圖譜變化，分析該反應(yīng)的機理。

1.3.4 降氟工藝的單因素實驗 基于生石灰在其他氟溶液中的應(yīng)用條件［14］，生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的基本條件定為:生石灰添加量0.01g/m L，pH11.50，時間75m in，溫度(25±2)℃。改變其中的一個條件，固定其它條件分別分析其對生石灰降低酶解液中氟含量的影響。各因素濃度梯度為:添加量0.001～0.012g/mL;pH2.00～14.00(使用濃度為0.01mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié));時間4～120min;溫度2～50℃。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化降氟工藝 通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)，溫度對生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的影響較小，當(dāng)溫度為(25±2)℃時即可滿足條件，因此選擇CaO添加量(X1)、初始pH(X2)、時間(X3)3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。按Box－Bohnken設(shè)計法每因素取3水平，以降氟率為響應(yīng)值，使用Design Expert 8.0.5進行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)曲面模型，以得到最優(yōu)降氟工藝。因素設(shè)計表如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計表Table 1 Factors design of response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 XRD圖譜分析

圖1為生石灰吸附氟離子前后的XRD圖譜。吸附反應(yīng)前后XRD圖譜變化較大，其中a圖譜在2θ= 37°、54°、32°、64°和67°出現(xiàn)明顯的峰，這與CaO標準樣(01－077－2376)在強度、峰位置以及峰高上匹配良好;b圖譜在2θ=34°、51°、28°、47°、54°、63°、37°出現(xiàn)明顯的峰，這與 Ca(OH)2標準樣(00－044－1481)匹配得分達88，與CaF2也有良好的匹配，可見生石灰與溶液反應(yīng)后形成Ca(OH)2，部分Ca(OH)2又與溶液中的F－反應(yīng)形成CaF2。這說明，生石灰吸附氟離子的反應(yīng)是一個離子交換的化學(xué)反應(yīng)過程。

圖1 生石灰XRD衍射圖譜Fig.1 XRD patterns of quick lime

2.2 氟離子標準曲線的繪制

按GB/T5009.18－2003食品中氟的測定中的氟離子選擇電極法獲得氟離子標準曲線為y=－50.722x+290.18，R=0.9997。其中y為電位(mV)，x為氟離子濃度的對數(shù)()，線性關(guān)系良好。測得

1.3.1條件下南極磷蝦水解液中氟含量為17.17mg/kg。

2.3 生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的單因素實驗

2.3.1 生石灰添加量的確定 實驗以生石灰添加量10－3g/m L為基礎(chǔ)，逐步提高生石灰添加量來研究其對降氟率的影響。如圖2所示，生石灰添加量為1× 10－3～7×10－3g/m L范圍內(nèi)，隨著生石灰添加量的增加，降氟率從21.26%迅速增加到74.67%，漲幅為53.41%，而生石灰添加量為7×10－3～12×10－3g/m L范圍內(nèi)，降氟率只增加了8.56%，這說明生石灰添加量為0.14g時即接近添加量高點，同時，由于添加過量的生石灰會造成酶解液的酸澀味和苦味，因此生石灰的添加量并非越多越好，故選擇7×10－3～10× 10－3g/m L響應(yīng)面因素取值范圍。這可能是由于當(dāng)生石灰量過高時，活性部位重疊導(dǎo)致降氟速率下降，活性部位的減少導(dǎo)致交換粒子的凝集［19］。

2.3.2 pH的確定 實驗分析了pH2.00～13.00范圍內(nèi)降氟率的變化情況。由圖3可知，當(dāng)pH11.50時降氟率達到最大，為82.47%，比pH2.00時高46.19%，比pH13時高3.55%。因此選擇11.50為反應(yīng)的最適pH。根據(jù)鈣鹽在其他降氟實驗中的應(yīng)用條件發(fā)現(xiàn)pH選擇范圍為7.0～11.8［20］。生石灰在溶液中部分以Ca2+形式存在，若溶液環(huán)境呈堿性，則Ca2++2OH－= Ca(OH)2反應(yīng)向右進行，加速生石灰中Ca2+的釋放，但由于該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)達到平衡時，OH－量的增加不會引起Ca2+量的變化，反而由于生成的Ca(OH)2微溶于水而造成Ca2+濃度的下降，因此本實驗選擇pH10.00～11.50為響應(yīng)面因素取值范圍。

圖2 生石灰添加量對降氟率的影響Fig.2 Effect of CaO doseage on fluoride removal rate

圖3 pH對降氟率的影響Fig.3 Effect of pH on fluoride removal rate

2.3.3 時間的確定 不同時間條件下生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量如圖4所示。反應(yīng)時間為4m in時，降氟率即已達到78.92%，反應(yīng)時間為75m in時，降氟率為83.23%，之后再增加反應(yīng)時間降氟率沒有任何變化。這說明生石灰吸附南極磷蝦酶解液中氟離子的反應(yīng)是一個快速的過程。因為生石灰吸附氟離子是化學(xué)反應(yīng)過程，反應(yīng)速率大，短時間內(nèi)即可完成，因此4min內(nèi)降氟率已達到很高，但由于F－和OH－存在競爭作用，該競爭作用存在下反應(yīng)達到平衡時所需的時間為75m in，之后溶液體系是一個平衡體系，F(xiàn)－濃度不再發(fā)生變化，即降氟率維持83.23%不變。但由于反應(yīng)時間增長會相對降低反應(yīng)速率，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)上的設(shè)備利用率及能耗等問題，選擇45～75min為響應(yīng)面因素取值范圍。

圖4 時間對降氟率的影響Fig.4 Effect of time on fluoride removal rate

2.3.4 溫度的確定 由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為2℃時，降氟率為76.88%，當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時，降氟率為83.23%，之后，再增加反應(yīng)溫度降氟率沒有變化。這說明溫度為室溫25℃是該反應(yīng)的最佳溫度。在實際實驗或生產(chǎn)過程中，25℃是室溫環(huán)境，同時避免了高溫或低溫引起的成本和能源的浪費，因此，生石灰降低南極磷蝦酶解液中氟含量的溫度即取25℃。

圖5 溫度對降氟率的影響Fig.5 Effect of temperature on fluoride removal rate

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析 根據(jù)表3的方差分析結(jié)果知，模型的p值極顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著(p=0.3830＞0.05)，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)=97.31%，說明殘差相互獨立，建立的模型極顯著，失擬項不顯著，實驗誤差小，因此本實驗建立的回歸模型可信。

表2 Box－Bohnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box－Bohnken design scheme and responsivity result

表3 因素的方差分析Table 3 Variance analysis of factors

使用Design Expert 8.0.5對實驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合，手動除去不顯著的項X1X3得到的回歸模型方程為:Y=84.49+4.29 X1+2.77 X2+0.18 X3－0.93 X1X2－1.09 X2X3－2.11－0.55+0.81，其中Y為降氟率。

根據(jù)回歸模型得到降氟率最大時的優(yōu)化組合為X1=0.79，X2=1.00，X3=－1.00，即生石灰添加量為0.009685g/m L，pH11.50，時間為45m in時，生石灰對南極磷蝦酶解液中氟離子的吸附能力最強，達到89.77%。最優(yōu)組合同單因素實驗結(jié)果基本一致。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析 手動優(yōu)化后，圖6和圖7為回歸方程中的交互項所作的響應(yīng)曲面圖。從圖6中可以看出，在給定范圍內(nèi)，降氟率隨著pH的升高而增大，隨著生石灰添加量的增加而增大，隨著時間的延長而增大。且生石灰添加量與pH的交互作用比較顯著，而與時間的交互作用影響不顯著，這與模型數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

圖6 生石灰添加量和初始pH對除氟率的影響Fig.6 Effect of addition amount of quick lime and original pH on fluoride removal rate

圖7 時間和初始pH對除氟率的影響Fig.7 Effect of time and original pH on fluoride removal rate

2.4.3 驗證實驗 根據(jù)回歸模型得到降氟率最大時的優(yōu)化組合即生石灰添加量為0.009685g/m L，pH為11.50，時間為45m in，溫度為(25±2)℃條件下進行3次驗證實驗，所得降氟率為88.25%±1.43%，實際值與預(yù)測值有著良好的吻合性。

2.4.4 水解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化 生石灰在降低南極磷蝦水解液中氟含量的同時可能會對水解液中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生影響。因此，以短肽得率和氨基態(tài)氮為指標來反應(yīng)水解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況。表4反映了生石灰加入南極磷蝦水解液前后TCANSI和DH的變化，從表4中數(shù)據(jù)可知，生石灰加入南極磷蝦水解液后TCA－NSI降低了2.55%，DH降低了7.85%。根據(jù)圖1生石灰加入南極磷蝦水解液前后XRD圖譜變化情況可知，反應(yīng)后除了Ca (OH)2和CaF2外，并未引入其他新的雜質(zhì)，因此可以認為加入生石灰后對南極磷蝦的營養(yǎng)成分含量影響不大。

表4 反應(yīng)前后TCA－NSI和DH的變化Table 4 Changes in TCA－NSIand DH before and after reaction

2.4.5 反應(yīng)結(jié)束后降氟材料的去除 由于生石灰與南極磷蝦水酶液中氟離子反應(yīng)結(jié)束后溶液是固液混合體系，為了實現(xiàn)南極磷蝦酶解液的食用，必須去除該體系中懸浮的Ca(OH)2和CaF2。本實驗采用將水解液通過直徑為0.40μm的濾膜，沉淀物Ca(OH)2和CaF2會被過濾在濾膜之外，濾液即為降低了氟含量的南極磷蝦水解液。殘留的鈣離子濃度為0.02mol/L，滿足人體需求。

3 結(jié)論

生石灰能降低南極磷蝦酶解液中的氟含量，該反應(yīng)是離子型吸附反應(yīng)。

以降氟率為指標，以生石灰添加量(X1)、初始pH(X2)、時間(X3)為因素，對生石灰降低酶解液中氟含量進行了響應(yīng)面優(yōu)化實驗，建立了二次響應(yīng)面回歸模型 Y=84.49+4.29X1+2.77X2+0.18X3－0.93X1X2－1.09X2X3－－+。在此基礎(chǔ)上結(jié)合實際生產(chǎn)確定降氟最優(yōu)條件為生石灰添加量 0.009685g/m L，pH11.50，時間 45m in，溫度(25±2)℃，此條件下降氟率達到88.25% ±1.43% (p＜0.05)。

生石灰對酶解液營養(yǎng)影響較小。以短肽得率(TCA－NSI)和水解度(DH)為指標來反應(yīng)水解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況，降氟實驗結(jié)束后，水解液中TCA－NSI降低了2.55%，DH降低了7.85%。

反應(yīng)后體系通過0.40μm濾膜除去Ca(OH)2和CaF2，實現(xiàn)降氟材料的無殘留，此時溶液中鈣離子濃度為0.02mol/L，滿足人體健康需求。

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Study on removal efficiency of fluoride from Antarctic krill hydrolyzate using quick lime

LV Chuan－ping1，2，LIXue－ying1，YANG Xian－shi1，*，GUO Quan－you1
(1.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China; 2.Food Science College of ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China)

High－fluorine was a significant fac tor to restrict the develop ing of Antarc tic Krill in food industry.In this article，quick lim e was used to reduce fluorine content in Antarc tic Krill hyd rolyzate，this method was low－cost，effective and non－residual，so it p rovided technical references for comm ercialapp lication of Antarc tic Krillas food. There were quantities of kinds of absorp tion reac tion，the reaction between quick lime and fluoride from Antarctic krill hyd rolyzate was p roved to be ionic reac tion by analyzing XRD patterns.With fluoride removal rate as index，evaluation of removalefficiency of fluoride from Antarctic krillhyd rolyzate using quick lime was studied w ith sing le factor experiments and response surface op tim ization experiments，which inc luded quick lime add ition(X1)，initial pH(X2)，tim e(X3)and tem perature.Simultaneously，secondary response surface reg ression m odel was estab lished，which was Y=84.49+4.29 X1+2.77 X2+0.18 X3－0.93 X1X2－1.09 X2X3－2.11 X21－0.55 X22+0.81 X23，in which Y was fluoride rem oval rate.On this basis，combined w ith the p ractice，the op timal technology conditions were as follows:quick lime additive dosage 0.009685g/m L，pH 11.50，time 45m in，tem perature(25±2)℃，under this cond ition，fluoride removal rate was 88.25% ±1.43%(p＜0.05).After defluorination，TCA－NSI of hyd rolyzate reduced by 2.55%，DH of hyd rolyzate reduced by 7.85%，which p roved that nutrition constituents in Antarctic krill hyd rolyzate changed little.After defluorination reac tion，all of quick lime changed into Ca(OH)2and CaF2，as sed iment，they could be removed by 0.40μm filtration membrance，so the material of defluoridation was removed com p letely.

Antarc tic krill;fluoride removal;quick lime;response surface

TS254.1

A

1002－0306(2012)12－0106－05

2011－10－24 *通訊聯(lián)系人

呂傳萍(1986－)，女，研究方向:食品新產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量安全。

國家“863”計劃項目(2011AA090801);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2011T05)。