基于雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的水牛乳源酪蛋白的研究

向明霞，王麗娜，李子超，成希飛，徐明芳

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣東廣州 510632)

基于雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的水牛乳源酪蛋白的研究

向明霞，王麗娜，李子超，成希飛，徐明芳*

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣東廣州 510632)

利用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI－MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)水牛乳酪蛋白與其他乳源蛋白差異性進(jìn)行了研究。根據(jù)Image Master 2D Platinum圖像分析軟件對(duì)不同乳源酪蛋白的雙向電泳(2－DE)圖譜進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的匹配分析，獲得21個(gè)存在于水牛奶中，主要分布在低豐度蛋白區(qū)的差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析，得到4個(gè)屬于水牛奶酪蛋白的主要組分，另外發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與水牛奶中的蛋白有較高同源性的新組分。

水牛奶，酪蛋白，雙向電泳，質(zhì)譜

差異蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容，其核心在于尋找不同樣本之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別和變化。當(dāng)前，差異蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法仍以雙向電泳(2－DE)分離和質(zhì)譜(MS)鑒定聯(lián)合應(yīng)用為主。以2－DE技術(shù)進(jìn)行研究時(shí)，電泳圖上的差異蛋白點(diǎn)有三種表現(xiàn)形式:a.電泳遷移率的改變;b.蛋白點(diǎn)的出現(xiàn)或消失，蛋白點(diǎn)濃度的增大或減少;c.某種蛋白點(diǎn)分裂形成的異形體在濃度或位置上的改變［1］。蛋白質(zhì)鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一分支，傳統(tǒng)的鑒定方法有 Edman降解法、氨基酸分析法等。Edman降解法測(cè)定的肽序列非常準(zhǔn)確，但速度較慢，費(fèi)用較高。氨基酸分析法經(jīng)濟(jì)快速，但靈敏度低。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI－MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI－MS)等質(zhì)譜技術(shù)具有高敏感性、高分辨率，是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)定性研究不可缺少的工具［2-3］。近年來(lái)，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)人、母馬以及反芻動(dòng)物奶牛、綿羊和山羊［4］、小鼠［5］和小袋鼠［6］等乳蛋白質(zhì)組進(jìn)行了大量研究，例如，利用2－DE分析熱處理對(duì)乳蛋白的影響［7］、分析乳蛋白的遺傳多態(tài)性［8］等。Galvani等［9］選用pH3～7和pH4～7的兩種梯度膠條，采用2－DE對(duì)奶粉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并對(duì)凝膠分離到的幾個(gè)高豐度蛋白質(zhì)運(yùn)用MALDITOF－MS進(jìn)行了鑒定。然而，目前的研究主要集中在全乳蛋白及加工乳蛋白方面，而對(duì)水牛奶酪蛋白的研究則較少。本文主要通過(guò)2－DE研究水牛奶蛋白的主要組分及一些低豐度蛋白的分離，采用Image Master 2D Platinum圖像分析軟件對(duì)電泳圖譜上的水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白及山羊奶酪蛋白進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)匹配，獲得差異蛋白，并利用MALDI－TOF－MS和MALDI－TOF/TOF－MS鑒定這些差異蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏殺菌奶(水牛奶、荷斯坦乳牛奶、山羊奶)零售商;固相pH梯度干膠條 pH4～7，13cm，廣州捷倍斯生物科技有限公司;Nuclease Mix、IPG－BUFFER PH4－7NL、硫脲、碘乙酞胺(IAA) 廣州佰路生物科技有限公司;丙烯酰胺、Tris－Base、十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT) 廣州捷倍斯生物科技有限公司;甲叉丙烯酞胺 廣州展晨生物科技有限公司;尿素 Sigma公司;CHAPS、低熔點(diǎn)瓊脂糖、乙醇、乙酸、硫代硫酸鈉、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、甲醛、甘油、EDTA等 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)。

Image Scanner掃描儀 美國(guó) GE公司;4800 MALDI－TOF/TOF串聯(lián)時(shí)間飛行質(zhì)譜儀 美國(guó)ABI公司;KDC－2046型冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;Image Master 2D Platinum Software

AmershamBiosciences公司產(chǎn)品;Gene Quant pro紫外/可見(jiàn)光分光;EPS－601型 SDS－PAGE電泳儀; Ettan IPGphor3型等電聚焦儀等。

1.2 試劑的配制

1.2.1 儲(chǔ)備液 30%聚丙烯酰胺儲(chǔ)液(過(guò)濾使用，棕色瓶4℃ 冰箱保存);1.5mol/L Tris－Base，pH8.8;電泳緩沖液(含25mmol/L Tris－Base，192mmol/L甘氨酸，0.1%SDS);平衡儲(chǔ)液(含6mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，3.35%1.5mol/L pH8.8 Tris－HCl);裂解液儲(chǔ)液(含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，過(guò)濾使用，－20℃冰箱保存);水化儲(chǔ)液(含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，一次性濾膜過(guò)濾使用，－20℃冰箱保存)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)臨用配制的溶液 裂解液(100μL裂解液儲(chǔ)液，2μL IPG buffer，1.5μL 0.4g/m L DTT，1μL PMSF，1μL蛋白酶，1μL Nuclease Mix);水化液(500μL水化貯液，3.5μL 0.4g/m L DTT，2.5μL IPG buffer);膠條平衡緩沖液 A(20m L平衡儲(chǔ)液，0.2gDTT);膠條平衡緩沖液B(20m L平衡儲(chǔ)液，0.5g碘乙酞胺，充分混勻，避光配制);低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液(0.05g低熔點(diǎn)瓊脂糖，10m L電泳緩沖液，10μL溴酚藍(lán)，加熱溶解至澄清，室溫保存);敏化液(75m L乙醇。0.79g硫代硫酸鈉，10.25g無(wú)水乙酸鈉，175m L二級(jí)純水);萃取液(50%CAN、5%TFA混合液);脫色液(30mmol/L K3Fe(CN)6和100mmol/L Na2S2O3等體積混合)。

1.3 樣品的制備

取新鮮牛奶，4000 r/m in離心30m in，收集下層脫脂乳，調(diào)pH至4.6，4000 r/min離心15min。沉淀用蒸餾水洗滌2次，丙酮洗滌2～3次，每次4000 r/m in離心10m in，最后將沉淀自然風(fēng)干，－20℃冰箱中保存。稱(chēng)取1mg酪蛋白，加入裂解液，振蕩，充分溶解后，4℃，4000 r/m in離心1h，取上清液，用brand ford法測(cè)量蛋白樣品的相對(duì)上樣濃度，計(jì)算上樣量(蛋白樣品的上樣量為60μg)。將蛋白溶液的體積用水化液補(bǔ)充至250μL，振蕩混勻樣品后，以13200 r/m in、4℃離心30m in取上清液上樣。

1.4 雙向電泳

1.4.1 第一向等電聚焦 酒精擦拭IPGphor的平板電極，去除表面被氧化的部分，待酒精揮發(fā)完全備用;取出－20℃冷凍保存的IPG預(yù)制干膠條，室溫放置平衡10m in;膠條槽平行放在IPGphor的平板電極上，將樣品均勻加入膠條槽中，取室溫平衡的膠條，用鑷子輕輕的去除干膠條上的保護(hù)膜，分清膠條的正負(fù)極，將膠面向朝下放入膠條槽中，膠條吸脹15m in;加入1m L覆蓋油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā);對(duì)好正負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。S1 30V 12h;S2 500V 1h;S3 1000V 1h;S4 8000V 64000Vh;S5 2000V保持10h。

1.4.2 膠條的平衡 第一次平衡:將聚焦好的膠條用濾紙輕輕吸干膠條上的礦物油，轉(zhuǎn)移至平管加入10m L平衡緩沖液A，膠面朝上放入平衡管中。置于搖床上平衡13min。第二次平衡:倒掉平衡液A，加入平衡液B，同上平衡13min。

1.4.3 第二向SDS－PAGE電泳 將平衡好的膠條用電泳緩沖液沖洗三遍，膠面朝外貼在玻璃外板上，轉(zhuǎn)移到13.5%聚丙烯酰胺凝膠膠面上，輕壓膠條使之與膠面充分結(jié)合(盡量不要產(chǎn)生氣泡)。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠封膠液封口，放置15m in，待封膠液徹底凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時(shí)恒流 15mA/塊膠，15m in后改為30mA/塊膠，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到距底部邊緣0.5cm時(shí)即可停止電泳。將膠轉(zhuǎn)移到染色盒中固定。

1.5 銀染、圖像采集與分析

凝膠用含10%乙酸和40%乙醇的固定液固定1h以上;敏化液中敏化30m in;二級(jí)純水漂洗四次，每次10m in;用含0.25%AgNO3，0.04%甲醛(臨用前加入)的銀染液避光銀染30min;二級(jí)純水漂洗3～4次，每次0.5m in;加入含2.5%Na2CO3，0.04%甲醛(臨用前加入)的顯色液，振蕩顯色2～10m in，直至出現(xiàn)合適的蛋白點(diǎn);在含1.46%EDTA的終止液中終止反應(yīng)10m in。使用二級(jí)純水沖洗膠面，用Image Scanner掃描儀同一參數(shù)掃描并保存，然后用Image Master 2D Platinum進(jìn)行圖像分析。

1.6 差異蛋白的膠內(nèi)酶解

用刀片切下膠上目標(biāo)膠點(diǎn)，依次置于已編號(hào)的EP管中，水洗膠塊2次，振蕩，吸出液體;加入新鮮的脫色液，待凝膠變成無(wú)色時(shí)立即吸出脫色液，水洗2次;先用50%乙腈脫水，再用100%乙腈脫水至膠塊完全變白，吸出液體;100mmol/L NH4HCO3吸脹5m in，吸出液體，加入新鮮的脫色液，待凝膠變成無(wú)色時(shí)立即吸出脫色液，水洗2次;每管加入2～4μL酶解工作液，待膠吸脹后，加20μL覆蓋液，37°C水浴酶解16h，5000×g離心1m in，上清液移到新的EP管中;在剩余膠塊中加入萃取液，37°C水浴30m in，超聲10min后離心，上清液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的裝有酶解液的EP管中，混合后于真空干燥離心機(jī)中凍干。

1.7 質(zhì)譜鑒定

凍干樣品用2μL樣品溶解液溶解，然后與基質(zhì)工作液按1∶1體積比(0.4μL)點(diǎn)樣于樣品板上，結(jié)晶后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。采用ABI4800 MALDI－TOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)鑒定，質(zhì)譜操作采用正離子反射模式，每個(gè)樣品質(zhì)譜信號(hào)累計(jì)掃描600～800次，掃描范圍為800～4000u。從一級(jí)質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜中選擇信噪比(S/N)大于50的五個(gè)得分最高的前體離子做MS/MS分析，質(zhì)譜信號(hào)累計(jì)掃描900～1200次，得到其序列信息，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。將得到

表1 差異蛋白相關(guān)信息Table 1 Information of differential proteins

2 結(jié)果與討論

2.1 乳源酪蛋白差異性的比較

在相同條件下，分別對(duì)水牛奶酪蛋白與乳牛奶酪蛋白、山羊奶酪蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳分離，銀染后將掃描的圖像用Image Master 2D Platinum圖像分析軟件進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的匹配分析。在分析報(bào)告中，以水牛奶酪蛋白的分離圖譜做為參照，選擇僅在水牛奶中存在的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，共獲得21個(gè)差異蛋白點(diǎn)。其中，水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白的2－DE圖譜分析顯示有14個(gè)差異蛋白點(diǎn)(圖1);水牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白的2－DE圖譜分析顯示有10個(gè)差異蛋白點(diǎn)(圖2)。由圖可知，三種乳源酪蛋白在主要組分上的差異較小，主要在一些含量較少的低豐度蛋白區(qū)有顯著差異。

圖1 水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白的差異蛋白分析Fig.1 Analysis of differential proteins ofwater buffalo casein and bovine casein

圖2 水牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白的差異性蛋白分析Fig.2 Analysis of differential proteins of water buffalo casein and goat casein

2.2 酪蛋白差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

挑選2－DE電泳圖譜中一些差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶解后進(jìn)行MALDI－TOF－MS和MALDI－TOF/ TOF－MS鑒定分析。選擇一級(jí)質(zhì)譜最多前5個(gè)母離子做二級(jí)質(zhì)譜分析，從Mascot軟件得到MS和MS/ MS的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，按得分、匹配的片段數(shù)和覆蓋率等進(jìn)行綜合評(píng)判搜索結(jié)果。肽段或二級(jí)片段的得分超過(guò)它的閾值(threshold)的被視為鑒定出的肽段和片段，所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為鑒定的蛋白質(zhì)，其可信度大于95%，如果有多個(gè)結(jié)果超過(guò)閾值，一般只取排名第一的質(zhì)譜結(jié)果。

差異蛋白點(diǎn)斑點(diǎn)1的PMF圖譜見(jiàn)圖3。根據(jù)適當(dāng)?shù)暮少|(zhì)比(m/z)選擇7個(gè)峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定(見(jiàn)圖4)，得到氨基酸序列，將PMF數(shù)據(jù)和7個(gè)序列的數(shù)據(jù)進(jìn)行混合NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)，獲得得分，鑒定出蛋白，用同樣的方法鑒定出其他差異蛋白斑點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，得到6個(gè)差異蛋白點(diǎn)，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，其中的4個(gè)蛋白點(diǎn)是水牛奶酪蛋白的主要組分，其得分分別為366，256，113和110。另外兩個(gè)可能是某種未知蛋白，因而僅搜索到與之同源性極高的組分，其得分分別為257和88，其肽指紋圖譜還有待進(jìn)一步的研究。

圖3 1號(hào)差異蛋白質(zhì)的PMF圖Fig.3 PMFmap of differential protein 1

3 結(jié)論

現(xiàn)今差異蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法仍以2－DE分離和MS鑒定聯(lián)合應(yīng)用為主。對(duì)雙向凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行微量定性鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)之一，肽質(zhì)譜指紋圖分析方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高等分辨率及高通量等特點(diǎn)，是2－DE膠上鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)最廣泛使用的方法之一，是生命科學(xué)等領(lǐng)域一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，為許多實(shí)驗(yàn)室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法。

本文利用雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)水牛酪蛋白和其他乳源酪蛋白差異性進(jìn)行了研究。水牛奶酪蛋白在雙向電泳圖譜上根據(jù)分子量和等電點(diǎn)的不同，可分離出αs1－、αs2－、β－和 κ－酪蛋白4種主要組分，各組分因分子量和等電點(diǎn)的不同，在圖譜上分布于凝膠的不同部位。利用Image Master 2D Platinum圖像分析軟件分別對(duì)水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白、山羊奶酪蛋白的2－DE圖譜進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的匹配分析，獲得21個(gè)存在于水牛奶中的差異蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)主要分布在低豐度蛋白區(qū)。將差異蛋白點(diǎn)切膠回收，經(jīng)胰蛋白酶解后，用MALDI－TOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析，得到4個(gè)屬于水牛奶酪蛋白的主要組分，另外發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與水牛奶中的蛋白有較高同源性的新組分，為發(fā)現(xiàn)水牛奶中未知蛋白提供了依據(jù)。

圖4 1號(hào)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的MS/MS圖Fig.4 MS/MS spectra of differential protein 1

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Analysis of water buffalo m ilk in south China by two－dimensional electrophoresis and mass spectrometry combined technology

XIANG M ing－xia，WANG Li－na，LIZi－chao，CHENG Xi－fei，XU M ing－fang*
(Department of Biotechnology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Two－d imensional elec trophoresis and matrix assisted laser desorp tion/ionization－tim e of flight mass spectrometry(MALDI－MS)comb ined technology was used to analysis the d ifferences between in water buffalo m ilk in south China and other m ilk p roteins.21 d ifferential p roteins which mainly d istributed in areas of low abundance existed only in water buffalo m ilk were identified by com paring two－d imensional electrophoresis (2－DE)map of casein spots m atching analysis w ith software of image m aster 2D p latinum.Four casein frac tions mainly could belong to water buffalo casein and two new fractions which were high homology components w ith water buffalo casein were determ ined w ith the further analysis by mass spectrometry(MS).

buffalo m ilk;casein;two－dimensionalelectrophoresis;mass spectrometry

TS252.1

A

1002－0306(2012)12－0188－04

2011－10－21 *通訊聯(lián)系人

向明霞(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。