葛 亮, 房耀維, 吳文惠, 王淑軍, 呂明生, 焦豫良, 劉 姝

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港市 222005)

海洋細(xì)菌LP621右旋糖苷酶分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

葛 亮1,2, 房耀維2, 吳文惠1, 王淑軍2, 呂明生2, 焦豫良2, 劉 姝2

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港市 222005)

對(duì)海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas tetraodonis LP621右旋糖苷酶進(jìn)行了50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的代謝特性的研究。結(jié)果表明LP621右旋糖苷酶合成和菌體生長(zhǎng)呈部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。據(jù)分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果采用 Logistic方程、Luedeking-Piret方程建立了描述菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)酶以及葡萄糖底物消耗分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算值結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值擬合良好, 較好反映了菌株右旋糖苷酶分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)特征。

右旋糖苷酶; 海洋細(xì)菌; 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型; Logistic方程; Luedeking-Piret方程

右旋糖苷酶(EC 3.2.1.11)可以切斷α-1, 6糖苷鍵,能夠有效阻滯唾液糖蛋白和粘性葡聚糖所組成的口腔牙菌斑形成, 對(duì)齲病的防治具有重要的意義[1-2]。同時(shí), 右旋糖苷酶可以用于催化水解高分子右旋糖苷合成血漿替代品, 在制糖工業(yè)中也可以用來(lái)增加糖的回收率, 降低黏度[3]。另外, 它可以增強(qiáng)藥物的化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度[4]。

目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的右旋糖苷酶生產(chǎn)菌株多來(lái)為陸生微生物, 存在的主要問(wèn)題是酶的最適作用溫度高(大多在50℃以上), 酶的最適作用pH低(大多pH 5), 從而導(dǎo)致抑制牙菌斑的效果差, 而海洋微生物因其生活的環(huán)境溫度較低, 其產(chǎn)生的酶在較低溫度下仍具有較高的活性。海洋交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)LP621的生長(zhǎng)溫度為4～37℃, 最適生長(zhǎng)溫度為 25℃; 在 pH 6. 0～11. 0 條件下生長(zhǎng)良好。該菌產(chǎn)生的右旋糖苷酶作用溫度低(30℃), 耐熱性較好, 具有較好的應(yīng)用前景[5]。

為了更有效地控制發(fā)酵生產(chǎn)[6-7], 提高右旋糖苷酶得率, 本文結(jié)合搖瓶發(fā)酵條件和發(fā)酵罐優(yōu)化的發(fā)酵數(shù)據(jù), 通過(guò)測(cè)定細(xì)胞濃度、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物濃度等對(duì)時(shí)間變化的情況, 觀察了海洋細(xì)菌LP621在50 L發(fā)酵罐的生長(zhǎng)及產(chǎn)物生成情況, 建立了細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型。

1 材料與方法

1.1 菌株

交替假單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)LP621[5], 由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/100mL)： 2216E 培養(yǎng)基, 酵母粉0.1, 蛋白胨0.5, pH8.0, 陳海水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)： 玉米淀粉0.61, 豆餅粉0.4,氯化鈉4, 磷酸二氫鉀0.1, 硫酸鎂0.05, pH6.55。

1.3 主要儀器與設(shè)備

50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐 MCGS, 上海佰倫科技生產(chǎn); Synergy HT型酶標(biāo)儀, 美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品;分光光度計(jì), 752型, 上海分析儀器廠生產(chǎn);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.4 種子液制備

從 LP621斜面上挑菌一環(huán)接于 2216E培養(yǎng)基,25℃, 180 r/min, 培養(yǎng)12 h左右, 再以1%(v/v)的接種量接入750 mL 2216E培養(yǎng)基中, 25℃, 180 r/min, 搖瓶培養(yǎng)12 h, 作為種子液。

1.5 發(fā)酵罐發(fā)酵

在50L發(fā)酵罐中裝入30 L發(fā)酵培養(yǎng)基, 接種量為 2.5%, 溫度控制在 25℃, 在 0～4 h控制通氣量為200 L/h, 轉(zhuǎn)速為250 r/min, 4～24 h控制通氣量為500L/h, 轉(zhuǎn)速350 r/min, 接種前加入終濃度為0.4%的誘導(dǎo)劑右旋糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔2 h取樣150 mL進(jìn)行菌體干質(zhì)量、殘?zhí)呛兔富盍Φ臏y(cè)定。文中所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù), 數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體干質(zhì)量測(cè)定

取100 mL發(fā)酵液, 10 000 r/min離心5 min, 棄去上清液, 用蒸餾水洗滌將沉淀洗滌, 相同條件離心, 棄上清, 重復(fù)3次, 再用蒸餾水洗滌后轉(zhuǎn)移到干燥皿, 80℃烘干到恒質(zhì)量, 稱(chēng)質(zhì)量, 即為100 mL菌體的干質(zhì)量, 換算單位為g/L[8]。

1.6.2 殘?zhí)菧y(cè)定

用硫酸蒽酮法測(cè)定殘?zhí)? 即取離心并稀釋一定濃度的發(fā)酵液1.0 mL于15 mL刻度試管中, 加入蒽酮試劑3 mL迅速浸入冰水浴中, 再用95℃水浴加熱6 min, 冷卻, 在分光光度儀上測(cè)波長(zhǎng)625 nm處吸光度, 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殘?zhí)堑牧縖9]。

1.6.3 酶活力測(cè)定

將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min, 取上清液作為粗酶液, 將100 μL粗酶液加入到100 μL 1%的右旋糖苷緩沖液中, 在30℃水浴反應(yīng)15 min, 用3,5－二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定還原糖量。酶活力單位定義： 在上述反應(yīng)條件下, 每分鐘催化產(chǎn) 1 μg麥芽糖的酶量為一個(gè)活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的特征

海洋細(xì)菌LP621菌株在50 L發(fā)酵罐上分批發(fā)酵的過(guò)程曲線如圖1所示, 由圖1可知, 菌體在接種以后短時(shí)間內(nèi)就進(jìn)入快速生長(zhǎng)期, 在8～20 h間保持較快生長(zhǎng)速度, 當(dāng)發(fā)酵到20 h時(shí)細(xì)菌進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期,菌體干質(zhì)量保持相對(duì)穩(wěn)定; 產(chǎn)酶曲線走勢(shì)基本接近細(xì)胞干質(zhì)量曲線趨勢(shì), 隨時(shí)間增長(zhǎng), 酶活逐漸升高,當(dāng)發(fā)酵20 h時(shí), 酶活達(dá)到最高值44.97 U/mL, 隨后顯著下降。海洋細(xì)菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵水平與目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的細(xì)菌相比較高, 但仍然不及部分真菌來(lái)源的右旋糖苷酶發(fā)酵水平, 如 Stefan等[10]于2007年分離到一株酵母菌Lipomyces starkeyi酶活力可達(dá)到83.9 U/mL。然而, LP621產(chǎn)生的右旋糖苷酶憑借發(fā)酵周期短, 安全性高, 耐熱性好, 最適作用溫度接近人體口腔溫度等特點(diǎn), 使得它在人類(lèi)牙菌斑的抑制的方面有著難以比擬的優(yōu)勢(shì)。

圖1 右旋糖苷酶在50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過(guò)程曲線Fig. 1 The batch cultivation curve of LP621 in 50L fermenter

基質(zhì)的消耗在發(fā)酵初期速度較慢, 4 h后下降趨勢(shì)顯著, 在24 h后降到2.70 g/L左右。從菌體生長(zhǎng)與右旋糖苷酶合成的關(guān)系來(lái)看, LP621產(chǎn)生右旋糖苷酶的發(fā)酵應(yīng)屬部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立與擬合分析

2.2.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立與擬合分析

2.2.1.1 模型建立

由圖1可知, LP621的生長(zhǎng)曲線接近典型的S型曲線, 采用Logistic方程能夠較好地描述菌體的生長(zhǎng)規(guī)律, 反映出分批發(fā)酵過(guò)程中, 因菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)存在的抵制作用, 并能較好地?cái)M合分批發(fā)酵過(guò)程的菌體的生長(zhǎng)規(guī)律。

Logistic 方程：

式中,X為細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L);t為時(shí)間(h);μ為比生長(zhǎng)速率(h-1)

初始條件, 當(dāng)t=t0時(shí),X=X0, 積分得：

式中,μmax為最大比生長(zhǎng)率(h);Xmax為菌體生長(zhǎng)上限(g/L)。分批發(fā)酵開(kāi)始時(shí), 菌體濃度很低,X/Xmax項(xiàng)可忽略不計(jì), 式(1)表示菌體呈指數(shù)生長(zhǎng); 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束后, 在穩(wěn)定期時(shí)X=Xmax, 式(1)表示菌體停止生長(zhǎng)[11]。

應(yīng)用Origin8.1軟件編程, 進(jìn)行非線性擬合處理,確定參數(shù)估計(jì)值, 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)Tab. 1 Parameter values used for testing the model

將參數(shù)代入上述方程, 非線性擬合確立的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)模型為：

2.2.1.2 擬合分析

由圖 2可知, 模型計(jì)算細(xì)胞干質(zhì)量的數(shù)據(jù)與實(shí)際測(cè)得的數(shù)據(jù)基本吻合, 實(shí)驗(yàn)值與模型值平均相對(duì)誤差為 7.8%, 這說(shuō)明 Logistic方程能夠較好的模擬50 L發(fā)酵罐海洋細(xì)菌產(chǎn)右旋糖苷酶過(guò)程中的菌體干質(zhì)量隨時(shí)間的變化過(guò)程, 擬合曲線較為理想。進(jìn)入穩(wěn)定期的實(shí)驗(yàn)值的點(diǎn)比模型值較高, 可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗以及細(xì)胞利用率有關(guān)。

圖2 菌體生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值比較Fig. 2 Comparison of experimental data with calculated data of cell growth

2.2.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型的建立與擬合分析

2.2.2.1 模型建立

微生物的產(chǎn)物形成過(guò)程非常復(fù)雜, 為便于研究,提出了一些定性的描述, 其中 Gaden的觀點(diǎn)被廣泛接受, Gaden[12]將產(chǎn)物形成分為 3類(lèi)： 生長(zhǎng)偶聯(lián)型,即只是在菌體生長(zhǎng)時(shí)才有產(chǎn)物的生成; 部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型或稱(chēng)混合型, 即菌體生長(zhǎng)階段有部分產(chǎn)物生成,而大部分產(chǎn)物是在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期生成的; 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型, 即只有在菌體進(jìn)入穩(wěn)定期以后產(chǎn)物才開(kāi)始生成。Luedeking等[13]為此總結(jié)了下式描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系。

當(dāng)α＞0,β=0 時(shí), 為生長(zhǎng)偶聯(lián)型; 當(dāng)α＞0,β＞0 時(shí),為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型; 當(dāng)α=0,β＞0時(shí), 為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。由圖1可知, 本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物形成與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型, 故可用 Luedeking-Piret方程來(lái)描述其產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型。

應(yīng)用 Origin8.1軟件編程, 將式(3)和(4)代入方程,逐步迭代進(jìn)行擬合處理, 確定參數(shù)估計(jì)值(α、β見(jiàn)表1), 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 代入?yún)?shù)估計(jì)值, 得到產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型：

2.2.2.2 擬合分析

2.2.3 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立與擬合分析

2.2.3.1 模型建立

發(fā)酵過(guò)程中, 淀粉消耗主要用于細(xì)菌的生長(zhǎng)、基本生命活動(dòng)的維持和代謝產(chǎn)物的生成 3個(gè)部分。為方便建模的簡(jiǎn)化, 可將維持生命活動(dòng)的基質(zhì)消耗包括在長(zhǎng)菌階段, 因此右旋糖苷酶的分批發(fā)酵過(guò)程限制性基質(zhì)的消耗就可用下式來(lái)描述：

式中,k1表示用于菌體生長(zhǎng)的底物消耗常數(shù);k2表示用于產(chǎn)物形成的底物消耗常數(shù)。

應(yīng)用 Origin8.1 軟件編程, 將式(3)、(4)和(6)代入方程, 逐步迭代進(jìn)行擬合處理, 確定參數(shù)估計(jì)值(k1、k2見(jiàn)表1), 并求出參數(shù)的置信區(qū)間, 代入?yún)?shù)估計(jì)值,得到產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型：

2.2.3.2 擬合分析

由圖3可知, 在0～24 h內(nèi), 實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的平均相對(duì)誤差為 3.4%, 說(shuō)明所用模型能夠較好的描述整個(gè)右旋糖苷酶隨時(shí)間增長(zhǎng)的積累過(guò)程, 由動(dòng)力學(xué)模型和擬合圖形可以看出, 在達(dá)到穩(wěn)定期前右旋糖苷酶形成的類(lèi)型屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型。由圖 4可以看出, 該模型能較好地描述海洋細(xì)菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵過(guò)程中淀粉的消耗情況, 實(shí)驗(yàn)值與模型值的平均相對(duì)誤差為 7.1%, 說(shuō)明所擬合曲線能夠較好的反映基質(zhì)消耗與時(shí)間的關(guān)系, 在接近穩(wěn)定期時(shí),實(shí)驗(yàn)值比模型計(jì)算值偏低, 可能是由于底物消耗與菌體生長(zhǎng)的不均一所造成的。

圖3 酶活力的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值比較Fig. 3 Comparison of experimental data with calculated data of amylase activity

3 結(jié)論

圖4 殘?zhí)堑膶?shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值比較Fig. 4 Comparison of experimental data with calculated data of glucose consumption

本研究在搖瓶發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上, 探討在 50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵條件和動(dòng)力學(xué)特征。建立了 3個(gè)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型, 包括細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型。這3個(gè)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型方程能較好地描述海洋細(xì)菌 LP621產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)情況, 解釋其動(dòng)力學(xué)規(guī)律, 具有很好的適用性, 可為實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及底物消耗情況的預(yù)測(cè)與控制提供了理論依據(jù), 為工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化以及經(jīng)濟(jì)分析等奠定基礎(chǔ)。

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Kinetics analysis for dextranase of Pseudoalteromonas tetraodonis LP621 by liquid fermentation

GE Liang1,2, FANG Yao-wei2, WU Wen-hui1, WANG Shu-jun2, Lü Ming-sheng2,JIAO Yu-liang2, LIU Shu2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. School of Marine Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Dec.,24,2011

dextranase; marine bacteria; fermentation kinetic model; logistic equation; luedeking-Piret equation

The kinetics for dextranase of marine bacteria Pseudoalteromonas tetraodonis LP621 by liquid fermentation was studied. The results showed that the dextranase production was partially associated with the growth of LP621. Based on the result of batch fermentation, the kinetic models for cell growth, dextranase formation, sugar consumption were set up using Logistic equation and Luedeking-Piret equation. The calculated results of models well matched the experimental data. The model equations could well reflect the dextranase fermentation process and kinetic characteristic.

Q815

A

1000-3096(2012)07-0039-05

2011-12-24; 2012-03-22

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA09070302)

葛亮(1984-), 男, 碩士研究生, 研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物化學(xué), E-mail： frankgl@163.com; 王淑軍, 通信作者, 教授, 博士, 研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锘钚晕镔|(zhì), 電話(huà)： 0518-85895421, E-mail：shujunwang86@163.com

(本文編輯：梁德海)