胃腺癌cagA+幽門螺桿菌感染中HIF-1α和iNOS的表達(dá)及意義

張志廣，李 熳，聞淑軍，江 勇，翟浩宇，季英蘭

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科，天津300211）

胃癌目前是影響人類生存的惡性腫瘤之一，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)的感染已被公認(rèn)是胃癌的重要致病因子。但Hp感染后只有極少數(shù)發(fā)生胃癌，說明胃癌的發(fā)生除了Hp感染以外，還與Hp的菌株毒力因素、宿主本身的遺傳學(xué)因素及環(huán)境因素有關(guān)[1]。目前已熟知的Hp毒素是細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）和空泡細(xì)胞毒素（vaculating cytotoxin A,VacA）兩種，編碼它們的基因分別稱為cagA和vacA，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道cagA+Hp感染更易加重胃炎的炎癥程度和萎縮程度，并與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α是其活性的亞單位，它可以通過上調(diào)其下游的基因來進(jìn)一步參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS)就是其下游基因之一，其活性與許多腫瘤的血管生成密切相關(guān)[3]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道Hp感染，特別是cagA+Hp感染可通過活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)來穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)[4-5]。本文就cagA+Hp感染與胃癌的臨床病理關(guān)系及HIF-1α、iNOS的表達(dá)做一研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1998-2004年間手術(shù)切除的胃腺癌標(biāo)本，臨床資料和隨訪資料完整者198例，其中男137例，女61例，年齡26~86（65.28±11.24）歲。隨訪時(shí)間截止于2010年5月，術(shù)后生存時(shí)間為1~128月，平均生存時(shí)間為（38.25±25.06）月。其中c14呼氣試驗(yàn)證實(shí)138例患者為Hp陽性，其中男93例，女45例，年齡32~86（66.04±10.02）歲，根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)1997年第5版國際癌癥病期 （Tumor NodeMetastasis，TNM）分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期17例，Ⅱ期34例，Ⅲ期56例，Ⅳ期31例。組織學(xué)分級：腸型胃癌87例，彌漫型胃癌51例。以上結(jié)果均經(jīng)2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師重新閱片驗(yàn)證。

1.2 主要試劑 HIF-1α（1∶100稀釋，小鼠抗人，Labvision Neomarkers），iNOS（1∶100 稀釋，兔抗人，Santa Cruz）。PCR試劑盒購自大連寶生物有限公司。

1.3 常規(guī)免疫組織化學(xué)染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，微波熱修復(fù)，修復(fù)完畢后加入第一抗體，4℃過夜。免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，顯示系統(tǒng)為PV-6001/6002（北京中杉），DAB顯色，蘇木素復(fù)染。各指標(biāo)均設(shè)立相應(yīng)陰性及陽性對照。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）

取石蠟塊切片3片（厚12μm），經(jīng)二甲苯脫蠟后，消化液（500mg/L蛋白酶K，10mmol Tris-HCIpH 8.0，10 mmol NaC1，1 mmol EDTA，100 g/L SDS）消化，酚-氯仿抽提DNA，-20℃?zhèn)溆?。cagA引物序列：引物 1，5′-AATACACCAACGCCTCCAAG-3′，引物 2 5′-TTGTTGCCGCTTGCTCTC-3′，由大連寶生物有限公司合成。cagA PCR反應(yīng)體系為50μL，包括DNA模板2μL，cagA引物1和引物2各0.75μL，Taq DNA 酶 0.5μL，10×Taq緩沖液 5μL，PCR 染液 5 μL，dNTP 1μL，ddH2O 34.5μL。cagA PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min后，95℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取13μL擴(kuò)增水相用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，cagA在382 bp出現(xiàn)電泳帶為陽性。

1.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 HIF-1α及iNOS均以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)，HIF-1α也可見細(xì)胞核著色。隨機(jī)選擇10個(gè)有代表性的高倍鏡視野,每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，染色指數(shù)等于染色強(qiáng)度（基本不著色、淺黃、深黃和棕色分別為0、1、2、3分）與陽性細(xì)胞百分率（陽性細(xì)胞百分率 <5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分）計(jì)分的乘積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料以來表示。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較，組間計(jì)量資料比較應(yīng)用t檢驗(yàn)及Mann-Whitney檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線的差別，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cagA基因型與胃腺癌臨床病理資料之間的關(guān)系 通過判定在382 bp出現(xiàn)的凝膠電泳的顯影條帶（圖1），138例胃癌中95例為cagA+，43例為cagA-。

將138例胃癌患者按性別、年齡（≥60歲和＜60歲）、腫瘤位置、大小、浸潤深度、組織學(xué)分型、血行轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)cagA基因與胃癌的浸潤深度密切相關(guān)，P=0.023（表1）。

表1 cagA與胃腺癌臨床病理資料的關(guān)系Tab 1 The relation of clinicopathologic data between cagA and gastric adenocarcinom a

2.2 cagA+Hp組和cagA-Hp組之間HIF-1α和iNOS的差異表達(dá) HIF-1α和iNOS陽性表達(dá)可見于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核（圖2）。其在cagA+Hp組的表達(dá)均高于cagA-Hp組，P均<0.05（表2）。

2.3 cagA基因型與胃腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系 cagA+Hp感染組患者的平均生存時(shí)間為47.23個(gè)月，中位生存時(shí)間為34.55個(gè)月；cagA-Hp感染組患者的平均生存時(shí)間60.47個(gè)月，中位生存時(shí)間為42.73個(gè)月。cagA+Hp組和cagA-Hp組5年生存率分別是28.42%和32.56%。Log-rank值為3.166，P=0.075（圖 3）。

表2 cagA+Hp組和cagA-Hp組之間HIF-1α和iNOS的差異表達(dá)Tab 2 The differentialexpression of HIF-1αand iNOSbetween the groupsof cagA+Hp and cagA-Hp

3 討論

Hp在發(fā)達(dá)國家感染率達(dá)30%～50%，在發(fā)展中國家則高達(dá)80%～90%[6]。研究證實(shí)，Hp感染與胃炎、消化性潰瘍、MALT淋巴瘤及胃腺癌密切相關(guān)。但近20%~30%的感染者可終身攜帶Hp而不發(fā)??；50%以上的感染者僅有不同程度的慢性炎癥；10%~15%可發(fā)生消化性潰瘍；只有極少數(shù)發(fā)生胃部惡性腫瘤。說明胃癌的發(fā)生不僅僅與Hp感染有關(guān)，還與細(xì)菌的毒力因素，宿主的免疫反應(yīng)和基因多態(tài)性及環(huán)境因素有關(guān)。

目前研究較多的是cagA基因，它只存在于50%~60%的Hp菌株中，編碼細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）。幽門螺桿菌以IV型分泌系統(tǒng)將CagA直接注入宿主細(xì)胞，CagA進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)特定的激酶磷酸化，從而引起細(xì)胞骨架的重排以及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的變化，最終導(dǎo)致炎癥、免疫反應(yīng)，甚至細(xì)胞增殖、分化和凋亡平衡的改變，從而引起惡性病變的可能[7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，cagA+Hp感染與胃炎的炎癥程度和萎縮程度及癌變均密切相關(guān)，其致癌機(jī)制可能是：cagA+基因株產(chǎn)生多種毒素可導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞癌基因過度表達(dá)，產(chǎn)生內(nèi)源性突變物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變而發(fā)生胃癌；可使胃黏膜表皮生長因子濃度增高，氧自由基、超氧化物生成增加，引起細(xì)胞損傷及DNA斷裂誘發(fā)癌變；增加IL-8的分泌和一氧化氮合成，促進(jìn)胃黏膜損害，加速胃組織細(xì)胞凋亡與癌變[8-9]。

目前大部分研究關(guān)注于Hp感染與胃癌的預(yù)后，但報(bào)道結(jié)果并不一致[10-12]。來自于德國和意大利的2篇報(bào)道均顯示胃癌中Hp陽性感染者的預(yù)后要好于Hp陰性感染者，1篇來自中國的研究報(bào)告卻發(fā)現(xiàn)2者之間并無明顯差異，他們應(yīng)用RT-PCR方法檢測了Hp的mRNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)伴有高拷貝數(shù)的胃癌患者預(yù)后要稍好于低拷貝數(shù)者,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因可能是因?yàn)镠p的感染激發(fā)了患者對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，細(xì)菌本身的組分可誘導(dǎo)自身抗體出現(xiàn)，與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生交叉的免疫反應(yīng)所致。但這些結(jié)論仍然有爭議，因?yàn)槭澜绺鞯貙τ贖p感染的判定標(biāo)準(zhǔn)并非一致。

本研究第一次應(yīng)用PCR的方法檢測Hp的cagA基因型，并比較它與胃腺癌的臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后的意義。筆者發(fā)現(xiàn)cagA+Hp感染的胃腺癌大多呈深度浸潤，但與腫瘤大小、位置、Lauren分型、淋巴結(jié)和血道轉(zhuǎn)移及TNM分期無明顯關(guān)系。另外筆者還比較了cagA+Hp組和cagA-Hp組間的HIF-1α和iNOS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在cagA+Hp組中，二者均呈高表達(dá)，這可能是cagA+Hp感染的胃腺癌浸潤能力強(qiáng)的原因之一。因?yàn)镠IF-1α作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)下游的靶基因，如VEGF、EPO、iNOS等的轉(zhuǎn)錄，參與了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。iNOS可使胃黏膜內(nèi)一氧化氮（NO）產(chǎn)生增多，在常氧條件下，NO可以通過防止HIF-1α降解來穩(wěn)定它的表達(dá)，進(jìn)而形成良性循環(huán)[13]。已有研究顯示HIF-1α與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，而Hp感染是胃癌重要的始動(dòng)因素，Park等[4]研究發(fā)現(xiàn)胃上皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞對Hp感染產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)致使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和進(jìn)一步DNA損傷，胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS能在常氧狀態(tài)下導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)。Suzuki和August等[14-15]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)cagA+Hp感染可促發(fā)中性粒細(xì)胞更多的積聚，從而產(chǎn)生更多的ROS。Handa等[5]將cagA基因轉(zhuǎn)染至胃上皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CagA蛋白可定位于線粒體中并產(chǎn)生大量的ROS。綜上可見cagA+Hp的感染可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS，從而參與其致炎致癌的過程，這其中也涉及到HIF-1α的通路，他們共同參與了cagA+Hp的致癌機(jī)制。

本研究初步探討了cagA+Hp感染與胃腺癌的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)cagA+Hp感染者的預(yù)后要差于cagA-Hp患者，這可能與其促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，并進(jìn)一步穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)，上調(diào)其下游基因，如iNOS，來共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。筆者的病例數(shù)還較少，今后仍需進(jìn)行大規(guī)模的流行病調(diào)查來驗(yàn)證結(jié)論。

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