hTERT啟動(dòng)子引導(dǎo)hNIS基因重組腺病毒介導(dǎo)放射性核素的裸鼠顯像

趙興業(yè)，李 瑋，譚 建，王 澎，李 寧

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，天津300052）

報(bào)告基因指其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被檢測(cè)的基因。報(bào)告基因顯像則是通過(guò)將報(bào)告基因轉(zhuǎn)染給靶細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因從而顯影的一種方法?，F(xiàn)有的報(bào)告基因如熒光素酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS）等，可以通過(guò)光學(xué)成像，核素顯像，MRI等方法進(jìn)行檢測(cè)[1-2]。其中，NIS基因因?yàn)榭蓪⒓?xì)胞外的碘轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以可以方便地進(jìn)行放射性核素顯像。在既往研究中已證明使用脂質(zhì)體可在體外將NIS基因轉(zhuǎn)入大細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)，用篩選后的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，進(jìn)行放射性核素顯像[3]。但是，該研究存在脂質(zhì)體不能進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染的問(wèn)題。為解決以上問(wèn)題，構(gòu)建重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS（hTERT啟動(dòng)子引導(dǎo)hNIS基因表達(dá)的Adeasy系統(tǒng)重組腺病毒），并利用該重組腺病毒能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶向hNIS基因表達(dá)的特點(diǎn)對(duì)端粒酶陽(yáng)性膠質(zhì)瘤U87荷瘤裸鼠進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染及核素顯像。惡性膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，雖然可以通過(guò)手術(shù)、放療、化療、抗腫瘤藥物得到治療，但是遠(yuǎn)期效果很差，致死率高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移[4-5]。將hNIS基因作為報(bào)告基因的核素顯像技術(shù)應(yīng)用于膠質(zhì)瘤核素顯像，開(kāi)拓了靶向性核素顯像的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 U87細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存，并于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清（fetalbovine serum,FBS）的達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)液（Dulbecco’smodified Eagle’smedium,DMEM） 中培養(yǎng)。重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c品系裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPECT（Discovery VH）為美國(guó)GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的擴(kuò)增 將U87細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞達(dá)到60%融合。取病毒液Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR感染U87細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染7~10 d后，收集細(xì)胞并反復(fù)凍融，12 000 r/min離心后收集病毒上清。如此反復(fù)數(shù)次后，擴(kuò)增病毒至所需滴度，即5×109PFU。

1.2.2 測(cè)定轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞攝碘率[6]將U87細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)至80%融合，Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-EGFR按50感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）的病毒梯度來(lái)轉(zhuǎn)染并孵育1 h后更換為10%FBS的新DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行攝碘率測(cè)定。將18.5 kBq125I/孔U87細(xì)胞孵育40min，使用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS）沖洗2遍后，使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定每孔細(xì)胞的每分鐘放射性計(jì)數(shù)(countperminute,CPM)值。

1.2.3 Western blot檢測(cè)hNIS蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，然后采用10%十二烷基硫酸鈉--聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluioride,PVDF）膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜。選取Santa cruz公司的sc-48055為NIS基因一抗，美國(guó)Santa cruz的sc-2004為NIS基因二抗。然后加入ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液（美國(guó)Thermo），室溫1min。

1.2.4 膠質(zhì)瘤荷瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建 選取4周齡BALB/c雌性裸鼠每組4只，將1mL約5×106的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行右肩胛皮下注射，當(dāng)裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)至直徑10mm（約注射后3周），將重組腺病毒 Ad-hTERT-hNIS和 Ad-CMV-EGFR（5×109PFU/50μLPBS）分別進(jìn)行裸鼠瘤內(nèi)注射。U87細(xì)胞接種裸鼠同時(shí)開(kāi)始封閉甲狀腺，在裸鼠飲水中加入優(yōu)甲樂(lè)（L-T4）5mg/L，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以減少甲狀腺攝碘量從而最大限度地增加轉(zhuǎn)染腫瘤的攝碘率。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定U87細(xì)胞攝碘率 轉(zhuǎn)染Ad-hTERT-hNIS的U87細(xì)胞系的攝125I活性為 10 569.3±203.2，轉(zhuǎn)染Ad-CMV-EGFR的U87細(xì)胞系的攝125I活性為480.0±25.7。轉(zhuǎn)染hNIS基因后的U87細(xì)胞攝碘能力較對(duì)照組提高約22倍左右（t=101.23，P<0.01），表明經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的hNIS基因具有攝碘功能；hTERT啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能夠有效地啟動(dòng)hNIS基因表達(dá)。

2.2 Western blot檢測(cè) 使用 Western blot分析hNIS基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在U87細(xì)胞系中，hNIS蛋白在70 kDa有表達(dá)帶，見(jiàn)圖1。

3 討論

報(bào)告基因顯像是一種分子水平顯像方法。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題：如現(xiàn)有的報(bào)告顯像基因進(jìn)入人體需要合適的載體。目前常用的載體有脂質(zhì)體和病毒，但可惜的是，脂質(zhì)體載體不能進(jìn)行基因活體轉(zhuǎn)染；病毒載體中腺病毒等非逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)[8]；慢病毒載體等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，雖能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但因其安全性問(wèn)題和出毒量低等問(wèn)題，也不十分理想。

PET和SPECT等核醫(yī)學(xué)設(shè)備因具有高靈敏度更方便進(jìn)行相關(guān)報(bào)告基因顯像[9]。NIS基因已經(jīng)被證明具有作為報(bào)告基因的潛力。NIS基因能表達(dá)一種膜蛋白并將細(xì)胞外碘轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，該蛋白能介導(dǎo)放射性核素進(jìn)行顯像，如適用于SPECT的131I和123I，適用于PET的124I等。雖然NIS最重要的生理作用是轉(zhuǎn)運(yùn)碘，但也能轉(zhuǎn)運(yùn)其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似的陰離子，如不僅與碘具有類(lèi)似的理化性質(zhì)，而且在放射性核素顯像中具有相似的生物分布，所以同樣可用于顯像[10]。NIS基因作為一種報(bào)告基因具有非免疫原性、生理性表達(dá)只限于特定組織器官的優(yōu)點(diǎn)[11]。

hTERT啟動(dòng)子等腫瘤特異性啟動(dòng)子，用來(lái)在膠質(zhì)瘤中誘導(dǎo)特定基因表達(dá)的基因治療已得到了證實(shí)[12]。如Takeuchi等[13]已證實(shí)使用hTERT啟動(dòng)子系統(tǒng)誘導(dǎo)半胱天冬酶 (caspase)治療膠質(zhì)瘤獲得成功等。hTERT啟動(dòng)子在腫瘤目標(biāo)性治療中是一個(gè)很有希望的腫瘤選擇性啟動(dòng)子[14-15]。

此次研究是利用重組腺病毒在端粒酶陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤U87荷瘤裸鼠進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染及核素顯像的可能性進(jìn)行的。在前期研究中已發(fā)現(xiàn)使用hTERT啟動(dòng)子限制hNIS基因表達(dá)的腺病毒Ad-hTERT-hNIS，可以實(shí)現(xiàn)在端粒酶陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中引導(dǎo)hNIS基因的表達(dá)，而在端粒酶陰性的MRC-5細(xì)胞中則不能達(dá)到表達(dá)hNIS基因的目的。通過(guò)進(jìn)行體內(nèi)顯像實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-hNIS轉(zhuǎn)染荷瘤裸鼠24 h后可以實(shí)現(xiàn)荷瘤裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染和顯像，但因?yàn)檩d體本身的限制，顯像時(shí)間很有限，超過(guò)一定時(shí)間后就不再能進(jìn)行顯像。因?yàn)檎＜谞钕俳M織具有選擇性攝取和濃聚99Tcm的能力，雖然事先對(duì)裸鼠的甲狀腺進(jìn)行了左甲狀腺素屏蔽，但是屏蔽效果不理想，在裸鼠顯像中仍可看見(jiàn)裸鼠甲狀腺顯影。這都是在今后需要研究的問(wèn)題。

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