肌萎縮側索硬化患者腦脊液對間充質(zhì)干細胞增殖分化的影響

王云甫 楊 超 孫延鵬 孫 強 盧祖能

肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是運動神經(jīng)元疾病的主要類型，是一種進行性神經(jīng)變性疾病，由于上、下運動神經(jīng)元變性導致延髓、四肢、軀干、胸部及腹部肌肉逐漸無力和萎縮，多因呼吸肌麻痹而死亡其發(fā)病機制至今尚未完全清楚，也無特效治療。近年來隨著發(fā)病機制的研究，提出了許多神經(jīng)保護性治療措施，其中干細胞移植被認為是一種最有前景的治療措施［1，2］。本實驗在成功分離大鼠MSCs的基礎上通過體外模擬細胞移植的CSF微環(huán)境，將ALS患者和正常CSF分別與MSCs共培養(yǎng)，比較MSCs在不同CSF中向神經(jīng)元細胞增殖分化的程度，初步探討MSCs在不同CSF微環(huán)境中增殖分化的啟動機制，為臨床MSCs經(jīng)CSF移植治療ALS提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年健康SPF級SD（Sprague-Dawley）大鼠10只（雌雄不限），體重300 g左右，購自湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心。主要試劑：低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS及小鼠抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45 單 克 隆 抗 體 購 自 美 國Gibco公司。兔抗大鼠NESTIN抗體及兔抗大鼠NSE抗體均購自武漢博士德公司。腦脊液來源于湖北省十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的住院患者。CSF的獲得均經(jīng)過知情同意，在無菌原則下選擇腰椎3-4或4-5椎間隙穿刺。ALS患者的診斷符合1998年修訂版E1 Escorial標準。病例對照組為住院頭痛患者，經(jīng)過腦和脊髓影像學檢查排除運動神經(jīng)元病、顱內(nèi)感染、多發(fā)性硬化、腦梗死、腦出血及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等疾病，且腰穿CSF常規(guī)、生化及細胞學檢查均正常。

1.2 大鼠骨髓MSCs的原代培養(yǎng)及生物學鑒定采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs。健康成年SPF級SD大鼠經(jīng)過脫臼處死后，75%乙醇侵泡5min后，無菌分離雙側后肢股骨及脛骨，剪去包括骺板在內(nèi)的骨兩端，用10%FBS完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)皿，反復吹打骨髓細胞懸液至骨髓均勻分散，以106／cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，加入5 ml低糖DMEM（含10%的胎牛血清、青霉素100 u／ml、鏈霉素100 u／ml）的培養(yǎng)液，置5%的CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后換液，去掉懸浮的細胞，收集貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，之后每隔3 d換液1次。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況，當細胞生長至80%融合時，進行細胞傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的第3代（P3）細胞分別加入CD29、CD34、CD44、CD45等單克隆抗體，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達，進行細胞表型鑒定。

1.3 大鼠骨髓MSCs的共培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的第3代（P3）細胞，按0.5×105cells／孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，孔中預先放置好經(jīng)過多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片，用以細胞爬片，待細胞生長至80%左右融合時，吸出培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板隨機分為3組：ALS患者組、病例對照組、空白對照組。ALS患者組每孔加入10 ul ALS患者CSF和1ml培養(yǎng)基，病例對照組每孔加入10 ul正常CSF和1 ml培養(yǎng)基，空白對照組每孔僅加入1 ml培養(yǎng)基。

1.4 細胞增殖活性測定（MTT法） 分別于共培養(yǎng)后第1、4、7 d棄去原培養(yǎng)基，加入 MTT（5 mg／ml）溶液20 ul，37℃二氧化碳孵箱內(nèi)孵育4 h，小心吸取MTT溶液后，加入二甲基亞砜0.5 ml，振蕩15 min，酶標儀上選擇波長490 nm，測定吸光度（A）值。

1.5 免疫熒光檢測Nestin及NSE的表達水平分別另取上述3組共培養(yǎng)7 d的細胞爬片，吸出培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛2 ml固定30 min，蒸餾水洗凈后晾干，各組細胞按抗體說明書分別行Nestin和NSE免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 以密度梯度聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法獲得的骨髓MSCs接種1d后，倒置相差顯微鏡下可見大部分細胞貼壁生長，貼壁細胞為圓形、橢圓形，有突起，集落樣生長，但仍然殘留懸浮細胞；48 h首次換液后，在倒置相差顯微鏡下可見貼壁細胞數(shù)量增多，部分聚集成片，并有部分細胞呈扁平梭形，仍有少許懸浮細胞，至第7 d，梭形細胞明顯增多，集落逐漸擴大，僅有微量懸浮細胞，貼壁細胞呈梭形，細胞融合約達80%。第3代以后細胞純度不斷提高，形態(tài)較為單一，大多數(shù)為長梭形，放射狀排列（圖1）。經(jīng)流式細胞儀檢測，細胞陽性表達CD29（97.15%）和CD44（98.21%），陰性表達造血干細胞標志物CD34（6.05%）和CD45（6.12%），符合 MSCs的細胞表型特征［3，4］。

圖1 原代（A）和第3代（B）骨髓間充質(zhì)干細胞（倒置相差顯微鏡×100倍）

2.2 共培養(yǎng)后細胞的增殖活性測定 隨共培養(yǎng)時間的延長，各組細胞的增殖能力逐漸增加；不同的共培養(yǎng)環(huán)境，各組細胞的增殖能力不同。ALS組與病例對照組各時間點吸光度值（A）均明顯高于空白對照組，而ALS組與病例對照組各時間點吸光度值（A）無統(tǒng)計學差異，見表1。

表1 各組共培養(yǎng)細胞不同時間點吸光度值（±s，n＝5，A）

表1 各組共培養(yǎng)細胞不同時間點吸光度值（±s，n＝5，A）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.01；與病例對照組比較，△P＞0.05

組別 吸光度值1 d 4 d 7d ALS組 0.252±0.026＊△0.747±0.042＊△ 1.173±0.067＊△036病例對照組 0.227±0.028＊ 0.696±0.051＊ 1.098±0.059＊空白對照組 0.137±0.019 0.436±0.052 0.939±0.

2.3 共培養(yǎng)后MSCs Nestin、NSE免疫熒光染色

MSCs和不同CSF共培養(yǎng)7 d后部分細胞開始收縮，并出現(xiàn)細胞突起等出一般形態(tài)學變化，出現(xiàn)神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞形態(tài)，而空白對照組細胞形態(tài)仍然保持典型的梭形細胞形態(tài)。Nestin（圖2）、NSE（圖3）免疫熒光染色顯示，ALS患者組和病例對照組均有陽性細胞表達，光鏡下隨機數(shù)取10個非重疊視野（×100倍），計算Nestin、NSE陽性細胞占總細胞數(shù)的比例發(fā)現(xiàn)，ALS組與病例對照組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于空白對照組，且ALS組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于病例對照組，見表2。

圖2 各組細胞共培養(yǎng)7 d后的Nestin免疫熒光染色（光學顯微鏡×100倍）

圖3 各組細胞共培養(yǎng)7d后的NSE免疫熒光染色（光學顯微鏡×100倍）

表2 各組MSCs共培養(yǎng)7 d后表達Nestin和NSE的陽性細胞率 （xˉ±s，n＝10，%）

3 討 論

神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病大多數(shù)是由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷而導致大量神經(jīng)元結構和功能缺失，神經(jīng)損傷之所以難以逆轉是因為神經(jīng)纖維缺乏再生能力，嚴重影響疾病的治療和患者的臨床預后轉歸，成為人們面臨的難題。干細胞移植治療，可從結構和功能上對神經(jīng)系統(tǒng)進行修復和改善，在一定的條件下骨髓MSCs可以跨胚層分化成神經(jīng)元樣細胞。骨髓MSCs取材和體外擴增較方便，不受倫理學限制，且具有免疫原性弱的特點，可自體移植也可異體移植。近年來，MSCs移植治療ALS已成為臨床研究的熱點［5，6］。

目前大多數(shù)研究表明，骨髓MSCs在缺血或損傷的腦和脊髓組織中向神經(jīng)細胞方向的分化與局部損傷組織的微環(huán)境變化有關，特別是細胞因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），表皮生長因子（epidernal growth factor，EGF）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等的作用。神經(jīng)損傷時這些細胞因子表達增加，從而促進骨髓MSCs向神經(jīng)細胞分化［7］。損傷的機體能發(fā)出某種特異的分子信號，將干細胞募集到損傷部位并發(fā)揮其組織修復功能。干細胞移植并遷移定位到某組織后，在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，能定向分化成為所需的組織細胞類型或者可以通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，在體外實現(xiàn)干細胞的定向誘導分化。

骨髓MSCs的自我更新、增殖、遷移、分化與其所處的特殊微環(huán)境密切相關［8］。CSF中含有多種電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖和其他因子：例如bFGF、BDNF、GDNF等［9，10］。本研究采用不同來源的 CSF分別與MSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，ALS組與病例對照組的CSF均能促進MSCs的增殖，兩組細胞的增殖能力無明顯差異；培養(yǎng)后7 d可見大量具有典型神經(jīng)細胞形態(tài)的神經(jīng)元樣細胞，且表達神經(jīng)元特異性表面標志（Nestin、NSE），且ALS組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于與病例對照組空白對照組。我們推測，MSCs的分化需要一定的微環(huán)境，不同的CSF為骨髓MSCs的成神經(jīng)分化提供了不同的微環(huán)境；ALS患者的CSF可能存在某些損傷因子，更能促進MSCs向神經(jīng)元樣細胞的分化，從而參與了MSCs定向分化和神經(jīng)組織修復機制的啟動環(huán)節(jié)。

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