大鼠肥厚心肌組織CaN Aβ基因沉默的實(shí)現(xiàn)及對(duì)細(xì)胞肥大抑制作用

齊迎春，謝曉華，陳 雯，李朝暉

解放軍總醫(yī)院 南樓綜合外一科，北京 100853

左室心肌肥厚(myocardial hypertrophy，LVH)是高血壓、心臟瓣膜病以及心肌缺血等常見的心臟疾患發(fā)生發(fā)展過程中共同的病理生理過程之一，是目前公認(rèn)的心血管疾病發(fā)病及死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)在病理性心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-3]，抑制CaN通路為心肌肥厚的防治提供了一種全新的視角。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)作為一種新興的研究及治療手段，有巨大的潛在價(jià)值及重要的臨床診療意義。本研究采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒非病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以探討動(dòng)物水平心肌組織提高非病毒載體轉(zhuǎn)染效率的方式及安全、有效抑制CaN通路的方法。

材料和方法

1 主要試劑 Block-it U6 RNAi Entry載體試劑盒(Invitrogen)，TOP10感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，質(zhì)粒大提試劑盒(威格拉斯)，膠原酶Ⅱ(Sigma)，透明質(zhì)酸酶(Sigma)，聲諾維微泡(Sonovue，Bracco)，CaN Aβ多克隆抗體(Santa crutz)，RT-PCR系統(tǒng)(promega，A3500)，Trizol(Gibico)，PCR引物(賽百盛公司)。

2 動(dòng)物與分組 160-200g Wistar成年雄性大鼠(n=30)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為6組(每組5只)：1)假手術(shù)組：僅開腹，術(shù)后飲用正常水；2)“一腎一夾”模型組：術(shù)后26d處死。3)CaN Aβ心包腔內(nèi)干擾組：“一腎一夾”術(shù)后第20天，經(jīng)心包腔內(nèi)途徑轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6d后處死。4)CaN Aβ舌下靜脈干擾組：“一腎一夾”術(shù)后第20天，經(jīng)舌下靜脈途徑轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6d后處死。5)心包腔內(nèi)陰性對(duì)照組：以針對(duì)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)特定序列的干擾質(zhì)粒作為陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒，心包腔內(nèi)注射轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6d后處死。6)舌下靜脈陰性對(duì)照組：以針對(duì)GFP特定序列的陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒，舌下靜脈內(nèi)注射轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6d后處死。其中麻醉后未蘇醒2只。

3 “一腎一夾”高血壓心肌肥厚動(dòng)物模型制作 術(shù)前12h禁食。戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，開腹后暴露左腎腎蒂，分離腎動(dòng)脈，在近腹主動(dòng)脈端0.5cm處使用U型銀夾(內(nèi)徑0.2mm)夾住，使腎動(dòng)脈狹窄但血流未被完全阻斷。結(jié)扎右側(cè)腎動(dòng)靜脈及右側(cè)輸尿管，切除右腎，關(guān)腹。術(shù)后以1%氯化鈉代飲水。

4 質(zhì)粒制備 選取我們已在細(xì)胞水平上篩選的CaN Aβ基因的有效干擾片段1280(21bp)GCAAGAT GGCAAGAGTCTTCT，以針對(duì)GFP的GCTGACCCT

GAAGTTCATC(19bp)序列作為陰性對(duì)照[4]。根據(jù)Entry vector的特點(diǎn)設(shè)計(jì)單鏈寡核苷酸，退火處理合成雙鏈寡核苷酸，克隆至pENTRTM/U6載體中，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)大腸桿菌，培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)后挑取4個(gè)分離較好的單菌落，搖床過夜擴(kuò)增(37℃，180r/min)。菌落PCR初步鑒定，并取少量菌液測(cè)序(三博遠(yuǎn)志公司)，測(cè)序正確的菌種大量制備質(zhì)粒，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定質(zhì)粒濃度及質(zhì)量。

5 基因包載與檢測(cè) 用0.9%氯化鈉注射液稀釋2mg質(zhì)粒至總體積5ml，注入sonovue微泡凍干粉瓶中，振搖混合成乳白色，即微泡+質(zhì)?；鞈乙?。酶的配制：稱取透明質(zhì)酸酶0.8mg，膠原酶Ⅱ1mg，溶于0.9%氯化鈉注射液250μl。心包腔內(nèi)組取微泡+質(zhì)?；鞈乙?00μl與酶溶液250μl混合(每只心包腔內(nèi)注射液體總體積為750μl)。舌下靜脈組取微泡+質(zhì)?；鞈乙?00μl(含質(zhì)粒200μg，無酶)。微泡+質(zhì)粒懸液及微泡+質(zhì)粒+酶懸液各取50μl，另取僅加入0.9%氯化鈉注射液的sonovue微泡懸液50μl作空白對(duì)照，分別加入GelRed 0.5μl，GelRed可與DNA結(jié)合并在紫外光下激發(fā)熒光，使用熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒與微泡的黏附情況。鏡下可見(圖1)，sonovue微泡與質(zhì)粒共同孵育后，微泡表面光暈較單純的sonovue微泡表面光暈增厚，表明sonovue表面結(jié)合了一定的質(zhì)粒，加入酶溶液后，微泡的完整性以及質(zhì)粒與微泡的黏附不會(huì)受到明顯影響。

6 經(jīng)腹心包腔內(nèi)注射方法 參照既往報(bào)道[5]的方法，戊巴比妥鈉麻醉后固定。消毒后取上腹部中線切口約2-3cm，暴露膈肌，取自制套管針，以心臟上緣與肺交界、靠近鐮狀韌帶處進(jìn)針，水平向前刺入，有突破感后撤出針芯，將質(zhì)粒微泡及酶的混合液750μl注入心包腔內(nèi)，拔出套管針，以無菌紗布按壓針孔1-2min，關(guān)腹。

7 超聲導(dǎo)入 在心包腔內(nèi)注射后30min-1h、舌下靜脈注射同時(shí)進(jìn)行。使用Philips5500超聲儀、S3探頭，心前區(qū)去毛后涂藕合劑，將探頭垂直于心前區(qū)表面，照射參數(shù)為：二次諧波(頻率為1.3/2.6MHz)，機(jī)械指數(shù)MI 1.6，深度4cm，持續(xù)8min，心電觸發(fā)模式，每5個(gè)周期觸發(fā)1次。

8 檢測(cè) 下腔靜脈取血，采用日立7600全自動(dòng)生化儀測(cè)定血漿常規(guī)肝腎功能、心肌酶指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)/谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酐(Cr)/尿素氮(UN)/尿酸(Ua)、肌酸激酶(CK)/心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)/乳酸脫氫酶(LDH)。橫切面切取心室水平心肌組織50-80mg，提取總RNA，采用兩步法RT-PCR試劑盒，以β-actin為內(nèi)參(ctatcggcaatgagcggttc，cttaggagttgggggtggct)，觀察CaNAβ(agggatgttgcctagtgg，gtatgtgcggtgttcagg)及肥大相關(guān)基因心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)(ctgctagaccacctggaga，accaagctgtgtgacacacc)以及β-重鏈肌球蛋白(myosin heavy chain，β-MHC)(cccagaacaccagcctcatc，ctcttcctcatgcccttcaccgac)基因的mRNA水平。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，采用Champ Gel 3000凝膠分析儀掃描，以目的片段與內(nèi)參片段光密度之比作為mRNA的相對(duì)含量。切取左心室前壁臟層心包下少量薄層心肌組織50-80mg，方法同上進(jìn)行相關(guān)基因的mRNA水平檢測(cè)。另取小塊左室前壁心肌組織立即置-70℃冰箱保存，以CaN Aβ多克隆抗體(濃度1∶100)作為一抗，冰凍切片后進(jìn)行心肌免疫熒光檢測(cè)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以-x±s表示計(jì)量資料，采用SPSS15.0軟件行方差齊性檢驗(yàn)以及單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 心肌組織RT-PCR結(jié)果 橫切面切取心室水平心肌組織進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明“一腎一夾”模型組大鼠CaN mRNA水平及肥大相關(guān)基因ANF、β-MHC基因mRNA水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，但是“一腎一夾”模型組(0.43±0.09)、CaN Aβ心包腔內(nèi)組(0.36±0.10)、CaN Aβ舌下靜脈組(0.39±0.11)、心包腔內(nèi)陰性對(duì)照組(0.41±0.05)及舌下靜脈陰性對(duì)照組(0.43±0.14)之間比較，心肌組織 CaN Aβ、ANF、β-MHC mRNA水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。切取左心室前壁臟層心包下薄層心肌組織進(jìn)行相關(guān)基因的RT-PCR，結(jié)果表明心包腔內(nèi)干擾組大鼠與模型組及心包腔內(nèi)陰性對(duì)照 組 相 比，CaNAβmRNA水 平 及ANF、β-MHC基因mRNA均有明顯降低(P<0.05)。見表1。

2 血漿常見肝腎功能、心肌酶水平 各組之間心肌酶(CK/CK-MB/LDH)、肝功能(GPT/GOT)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，所有“一腎一夾”手術(shù)組血漿Cr水平較假手術(shù)組均有明顯增加(P<0.05)，BUN及Ua各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色后，CaN Aβ顯示為胞漿內(nèi)紅色熒光，心肌細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光?？梢娕c“一腎一夾”模型組比較，CaN Aβ干擾心包腔內(nèi)組大鼠心外膜下部分心肌細(xì)胞胞漿紅色熒光明顯減弱，說明細(xì)胞內(nèi)CaN Aβ蛋白含量相對(duì)較低。CaN Aβ干擾舌下靜脈注射組和各陰性對(duì)照組均無明顯減弱。見圖2。

表1 CaN Aβ、ANF、β-MHC基因mRNA 水平(心外膜下薄層心肌組織)Tab 1 Levels of CaN Aβ, ANF and β-MHC mRNA in myocardial tissue(-x±s)

討 論

心肌肥厚是高血壓、心臟瓣膜病、心肌缺血等常見心臟疾患的共同病理生理過程之一，與心血管病發(fā)病及死亡風(fēng)險(xiǎn)間存在明顯正相關(guān)[6]。CaN在病理性心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中起重要作用，多種因素如內(nèi)皮素、醛固酮、血管緊張素等均可上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞CaNAβ的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)心肌肥大的信號(hào)通路[7]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方式來抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá)，是誘導(dǎo)基因沉默、研究基因功能的重要手段。但安全、高效、高特異性的轉(zhuǎn)染載體及轉(zhuǎn)染方式一直是其臨床應(yīng)用的瓶頸，也是各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)?？梢酝ㄟ^非病毒載體或病毒載體的方式構(gòu)建，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但制備復(fù)雜，有一定的免疫原性，不適于體內(nèi)重復(fù)使用，而且病毒的基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生一定的毒性，同時(shí)還有整合突變、重組成能夠復(fù)制的病毒等風(fēng)險(xiǎn)；非病毒載體相對(duì)更為經(jīng)濟(jì)、操作簡便、易構(gòu)建、低毒性、無免疫原性、無傳染性，適于臨床重復(fù)應(yīng)用[8]，但非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)不如病毒載體，若能改善非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，它將更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究采用RNAi理論及技術(shù)，選擇質(zhì)粒非病毒載體，關(guān)鍵問題就是如何改善非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，獲得安全有效的目的基因(CaNAβ)的沉默，從而達(dá)到抑制心肌肥大的目的。

我們制作大鼠心肌肥厚模型，針對(duì)CaN Aβ既往驗(yàn)證的siRNA有效序列-1280(21bp)構(gòu)建小發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體(si1280)，采用心包腔內(nèi)及舌下靜脈內(nèi)注射輔以超聲導(dǎo)入的方法，在整體動(dòng)物水平轉(zhuǎn)染心肌組織，通過CaN Aβ基因mRNA水平及其蛋白表達(dá)的情況體現(xiàn)肥厚心肌組織CaN Aβ的抑制效果，并關(guān)注肥大相關(guān)基因ANF、β-MHC mRNA水平的變化。研究表明，“一腎一夾”模型組大鼠較假手術(shù)組CaNAβ基 因mRNA水 平 及ANF、β-MHC基因mRNA水平均明顯升高；切取左心室前壁臟層心包下薄層心肌組織檢測(cè)，心包腔內(nèi)干擾組大鼠與模型組及心包腔內(nèi)陰性對(duì)照組相比，CaN Aβ、ANF、β-MHC基因mRNA水平均有明顯降低；若以橫切面切取心室心肌組織，心包腔內(nèi)干擾組的CaN AβmRNA水平低于其他手術(shù)組，但上述基因mRNA水平在各手術(shù)組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與樣本量相對(duì)有限、有效的轉(zhuǎn)染較集中于心外膜下心肌組織等因素有關(guān)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果也提示，CaN Aβ干擾心包腔內(nèi)組大鼠心外膜下局部心肌細(xì)胞胞漿CaN Aβ蛋白含量下降，而CaN Aβ干擾舌下靜脈注射組和各陰性對(duì)照組CaN Aβ蛋白含量無明顯減少。

圖1 質(zhì)粒與聲諾維(sonovue)結(jié)合情況的檢測(cè)A：sonovue微泡；B：微泡+質(zhì)粒；C：微泡+質(zhì)粒+酶Fig 1 Binding of plasmid to sonovueA：Sonovue bubbles; B: Sonovue+plasmid; C: Sonovue+plasmid+enzyme

圖2 心肌組織CaN Aβ蛋白免疫熒光染色(×20)A：“一腎一夾”模型組；B：心包腔內(nèi)干擾組；C：舌下靜脈干擾組Fig 2 Immunofluorescence staining of CaN Aβ protein in myocardial tissue(×20)A: Hypertrophic model group; B: Intrapericardial RNAi group; C: Sublingual vein RNAi group

心包腔作為一個(gè)密閉腔，可充分延長心肌組織與載體的接觸時(shí)間，有利于目的基因在心肌組織的表達(dá)，并具有一定靶向性。本研究所采用的聲學(xué)造影劑微泡、超聲導(dǎo)入以及酶類的應(yīng)用，對(duì)減輕心包臟層對(duì)轉(zhuǎn)染的屏障作用、增加質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率起到了一定的輔助作用。其中，超聲微泡導(dǎo)入增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率的方式越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[9-10]，其原理主要是攜帶基因的聲學(xué)微泡在超聲作用下瞬間破裂，同時(shí)產(chǎn)生聲孔效應(yīng)，有助于載體更易到達(dá)組織[8]，此傳輸系統(tǒng)操作簡單、損傷較小而且有一定靶向性，最主要的是可提高轉(zhuǎn)染效率，彌補(bǔ)質(zhì)粒等非病毒載體轉(zhuǎn)染效率相對(duì)低下的不足。我們的研究同時(shí)表明，各組血漿常見肝酶、心肌酶含量無顯著差異，“一腎一夾”各手術(shù)組之間血漿Cr含量無顯著差異，提示經(jīng)舌下靜脈和心包腔內(nèi)途徑輔以超聲微泡導(dǎo)入的方式對(duì)心、肺、肝及腎等組織無明顯損傷，使其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用成為了可能。我們?cè)囼?yàn)所涉及的質(zhì)粒用量有待進(jìn)一步考究，以及超聲各個(gè)參數(shù)的優(yōu)化還需更為深入的研究，以獲得更為滿意的轉(zhuǎn)染效果。如能進(jìn)一步改善質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率(如輔以酶類)、增加心肌的靶向性(如使用心肌特異性啟動(dòng)子)、這種方法將會(huì)具有更大的臨床應(yīng)用潛力。

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