2-氯苯酚與取代苯酚及苯胺類化合物對(duì)鯽魚聯(lián)合毒性效應(yīng)的定量構(gòu)效關(guān)系

李志華,朱正麗,陸光華,趙海洲

(1.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210098;2.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210098;3.中國(guó)人民解放軍4812工廠,安徽 安慶 246001)

苯胺類化合物廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)聚氨酯、橡膠、化妝品、染料和農(nóng)藥等[1].取代苯酚類化合物被較多地用作農(nóng)藥、除草劑、染料和殺蟲劑等.其中,2-氯苯酚是一種重要的工業(yè)原材料,主要用于染料和有機(jī)合成[2].這些化合物不易降解[3],進(jìn)入水體后對(duì)水生生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖構(gòu)成了一定的危害[4],同時(shí)破壞了水生生態(tài)系統(tǒng),對(duì)人體健康有潛在的危害.

越來(lái)越多的污染物,尤其是人工合成的有機(jī)污染物通過(guò)各種途徑進(jìn)入水體且并存于環(huán)境中,將引起與各種污染物單獨(dú)作用時(shí)完全不同的毒性效應(yīng),只用單一毒物的含量去判斷水體污染后的毒性危害無(wú)法真實(shí)反映環(huán)境質(zhì)量要求,還應(yīng)從聯(lián)合毒性的角度對(duì)水質(zhì)污染做出綜合評(píng)價(jià).研究化合物在聯(lián)合體系中的交互作用與毒性效應(yīng),對(duì)制定環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、探討其毒性作用機(jī)理和采取防治對(duì)策等具有重要的意義.近年來(lái),對(duì)于聯(lián)合毒性效應(yīng)及其定量構(gòu)效關(guān)系的研究也逐漸開展[5-8].筆者測(cè)定了2-氯苯酚與其他取代苯酚及苯胺類混合物對(duì)鯽魚的聯(lián)合毒性效應(yīng),采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法對(duì)化合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行了定性評(píng)價(jià),并建立了聯(lián)合毒性效應(yīng)的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型,對(duì)聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行了定量預(yù)測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)材料與研究方法

1.1 受試生物與化合物

受試生物采用鯽魚(Carassius auratus),屬鯉科,購(gòu)自南京市勝利圩養(yǎng)殖場(chǎng).幼魚買來(lái)后,經(jīng)5%食鹽水消毒,選取健康個(gè)體,在實(shí)驗(yàn)室中馴養(yǎng)7d以上.實(shí)驗(yàn)用魚體長(zhǎng)(13±0.2)cm,體質(zhì)量(35±0.5)g.

10種取代苯酚及苯胺類化合物購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司(分析純).

1.2 單一毒性的測(cè)定

養(yǎng)魚用水為曝氣除氯3d后的自來(lái)水,總硬度為50～250mg/L(以碳酸鈣計(jì)),pH為6.5～7.5,溶解氧為(5.0±0.5)mg/L,水溫為(20±2)℃.采用自然光照.馴養(yǎng)期間魚的死亡率低于1%.實(shí)驗(yàn)前每2d換1次水.隔天喂食1次,每天投喂2～3次的投喂率約為體質(zhì)量的3%,實(shí)驗(yàn)前一天禁食.

將受試化合物溶解在95%的乙醇溶液中,作為儲(chǔ)備液.采用每天更換1/2實(shí)驗(yàn)液的半靜水式實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn).根據(jù)受試化合物預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按濃度的等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度梯度暴露10條鯽魚,設(shè)置空白對(duì)照,每個(gè)濃度梯度設(shè)2個(gè)平行,周期96h,每24h記錄1次魚體死亡率.死亡的魚體立即移出容器,以免影響水質(zhì).

1.3 聯(lián)合毒性效應(yīng)的測(cè)定

在獲得化合物單一毒性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,根據(jù)公式(1)計(jì)算混合物的毒性單位值之和M,以此為基礎(chǔ)設(shè)置混合物暴露的濃度梯度:

式中:UTi——混合物中組分 i的毒性單位;Ci——混合物中組分 i的質(zhì)量濃度;CL50i——組分 i對(duì)鯽魚的半致死濃度.

2-氯苯酚與其他化合物按照等毒性配比組成二元及多元混合物.同時(shí)還研究了2-氯苯酚與2-氯苯胺按照不同配比(1∶3,1∶1,3∶1)組成的二元混合物的聯(lián)合毒性.聯(lián)合毒性的實(shí)驗(yàn)方法與單一毒性實(shí)驗(yàn)相同.

1.4 聯(lián)合毒性的評(píng)價(jià)

2種或多種化學(xué)物質(zhì)同時(shí)作用于生物體時(shí),往往會(huì)引起與單一毒物作用完全不同的毒性反應(yīng),然而由于聯(lián)合毒性的復(fù)雜性,其研究進(jìn)展較為緩慢.本文采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法對(duì)12組混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià).

a.毒性單位法[9]:對(duì)于一個(gè) n組分的混合物來(lái)說(shuō),按照公式M0=M/(UTi)max及公式(1)計(jì)算得M0和M,式中(UTi)max為混合物中各組分毒性單位的最大值.當(dāng)M=1時(shí),聯(lián)合效應(yīng)為簡(jiǎn)單相加作用;當(dāng)1＜M＜M0時(shí)為部分相加作用;M＜1時(shí),聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同作用;M=M0時(shí)為獨(dú)立作用;當(dāng)M＞M 0時(shí)為拮抗作用.

b.相加指數(shù)法[10]:相加指數(shù)法的評(píng)價(jià)指數(shù)(IA)定義為IA=M-1(M=1時(shí));IA=1/M-1(M＜1時(shí));IA=-M+1(M＞1時(shí)).當(dāng)IA＜0時(shí),聯(lián)合效應(yīng)為拮抗作用,IA=0時(shí)為簡(jiǎn)單相加作用,IA＞0時(shí)為協(xié)同作用.

c.混合毒性指數(shù)法[11]:混合毒性指數(shù)IMT=1-lg M/lg M0.當(dāng)IMT＜0時(shí),聯(lián)合效應(yīng)為拮抗作用;IMT=0時(shí)為獨(dú)立作用;0＜IMT＜1時(shí)為部分相加作用;IMT=1時(shí),聯(lián)合效應(yīng)為簡(jiǎn)單相加作用;IMT＞1時(shí)為協(xié)同作用.

1.5 結(jié)構(gòu)參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析

本文中10種單一化合物的辛醇/水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值(lg P)從Biobyte軟件(ver.355,Biobyte company,Claremont,CA,USA)中查得,見表1.使用ChemOffice 2004軟件中MOPAC法對(duì)化合物分子進(jìn)行量能最小化及結(jié)構(gòu)最優(yōu)化處理,計(jì)算了分子最低空軌道能E LUMO(eV)、分子最高占有軌道能E HOMO(eV)以及前沿軌道能距ΔE(eV).化合物的參數(shù)值見表1.使用SPSS17.0(Ver.17.0 SPSSCompany,USA)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析.

表1 取代苯酚及苯胺類化合物對(duì)鯽魚的單一毒性數(shù)據(jù)及結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Single toxicity to Carassius auratus and structural parameters of substituted phenols and anilines

2 結(jié)果與討論

2.1 單一化合物對(duì)鯽魚的急性毒性

化合物對(duì)鯽魚96h單一毒性數(shù)據(jù)見表1.5種酚類的毒性從高到低的順序?yàn)?2,4,6-TCP,2-CP,3-CP,4-NP,3-NP,5種胺類的毒性從高到低的順序?yàn)?DPA,3,4-DCA,2-CA,3-CA,N-MA.同種類化合物中具有相同取代基,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,毒性高低順序?yàn)?2-CP,3-CP,4-NP,3-NP,2-CA,3-CA,在10種化合物中,可以看出2,4,6-TCP毒性高于2-CP和3-CP,3,4-DCA毒性高于2-CA和3-CA.由毒性高低比較可知,同種化合物相同取代基團(tuán)在鄰位和對(duì)位時(shí)的毒性比在間位的毒性要高,并隨著相同取代基團(tuán)數(shù)目的增加毒性也隨之增加.

2.2 2-氯苯酚與其他化合物的聯(lián)合毒性及其評(píng)價(jià)

本文采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法對(duì)聯(lián)合毒性作用方式進(jìn)行評(píng)價(jià).用相加指數(shù)法評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性時(shí),發(fā)現(xiàn)2-CP+2-CA等幾組的評(píng)價(jià)指數(shù)(IA)在-0.09～0.06之間,由于IA=0是一種理想的相加作用,而實(shí)驗(yàn)中存在誤差,即使是相加作用也很難得到 IA=0的結(jié)果,所以認(rèn)為聯(lián)合作用為部分相加[12].混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)及毒性評(píng)價(jià)結(jié)果見表2.

表2 混合物的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)及毒性評(píng)價(jià)結(jié)果Table2 Assessment of joint toxicity to Carassius auratus of mixtures

可見,毒性單位法和混合指數(shù)法評(píng)價(jià)取代苯酚與苯胺類混合物等毒性聯(lián)合時(shí)結(jié)果較一致,等毒性聯(lián)合主要表現(xiàn)為部分相加或協(xié)同作用,這表明,等毒性二元聯(lián)合時(shí)混合物的毒性都不同程度地增加,可能是因?yàn)榛旌衔锝M分中均含有2-氯苯酚,其組分中化合物的結(jié)構(gòu)都具有一定的相似性,這與楊永濱等[13-14]所得結(jié)果相同.毒性單位法和相加指數(shù)法評(píng)價(jià)二元不等毒性的聯(lián)合作用時(shí)結(jié)果較一致,二元不等毒性聯(lián)合作用時(shí)結(jié)果主要表現(xiàn)為拮抗作用,可能是因?yàn)榛旌衔锝M分的毒性不同,并隨著毒性配比的不同,其毒性隨之改變,互相有不同程度的抑制作用.

2.3 聯(lián)合毒性的QSAR研究

根據(jù)獨(dú)立作用的假設(shè),即混合物的分配作用是各組分分配作用的加和,而忽略組分間的相互作用,Lu等[15]采用方程(2)預(yù)測(cè)了混合物的辛醇/水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)(lg Pmix),并依據(jù)方程(2)類似地計(jì)算了混合物的前沿軌道能距 ΔEmix.

式中:lg Pa,lg Pb,lg Pi——混合物中組分 a,b和i的辛醇/水分配系數(shù)的對(duì)數(shù);Ca,Cb,Ci——組分 a,b和i在混合物中的質(zhì)量濃度.

筆者根據(jù)式(2)計(jì)算了12組混合物的lg Pmix和ΔEmix,結(jié)果見表3.

表3 混合物的聯(lián)合毒性及結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 3 Joint toxicity to Carassius auratus and structural parameters of mixtures

曾鳴等[16]測(cè)定了以鹵代苯為代表的非極性麻醉型混合物對(duì)湛江叉鞭金藻的聯(lián)合毒性效應(yīng),建立了基于混合物疏水性參數(shù)lg Pmix的QSAR模型:

Lu等[17]測(cè)定了27種酚類和胺類混合物對(duì)藻類的48h半數(shù)有效抑制濃度(CE50mix),以混合物的疏水性參數(shù)lg Pmix和電性參數(shù)ΔEmix為結(jié)構(gòu)描述符,建立了雙變量QSAR模型:

Wang等[18]測(cè)定了酚類和苯胺類混合物對(duì)斜生柵藻的半數(shù)有效抑制濃度(CE50mix),建立了基于混合物疏水性參數(shù)lg Pmix和電性參數(shù)ΔEmix的QSAR模型:

本文以混合物的lg Pmix和ΔEmix為描述符,建立了2-氯苯酚與取代苯酚、苯胺類混合物對(duì)鯽魚聯(lián)合毒性的QSAR模型:

式中:n——用于建模的混合物數(shù)目;R2——復(fù)相關(guān)系數(shù);Q2——交互式驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù);S.E——標(biāo)準(zhǔn)誤差;F——方差比;P——顯著性水平.

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷墓簿€性,按式(7)計(jì)算了變異膨脹因子(VIF):

VIF在1～5之間表示相關(guān)方程可以接受.方程(6)的VIF為3.1,表明方程(6)是可以接受的.該模型具有較為顯著的相關(guān)性,較小的估測(cè)誤差以及較好的預(yù)測(cè)能力(Q2=0.611).-lg CL50mix與分子結(jié)構(gòu)描述符lg Pmix呈正相關(guān),與 ΔEmix呈負(fù)相關(guān).從表3可見殘差最大的是0.28,占實(shí)測(cè)毒性的6.5%.由于Q2只有0.611,表明模型對(duì)未測(cè)試混合物的毒性預(yù)測(cè)能力不太理想.這可能是由于聯(lián)合樣本比較復(fù)雜,既含有二元聯(lián)合混合物,又含有三元混合物,同時(shí)二元聯(lián)合混合物還設(shè)定了不同毒性配比.為提高模型的預(yù)測(cè)能力可以考慮增加不同化合物不同濃度暴露下聯(lián)合毒性的樣本數(shù)量,同時(shí)添加預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證基.

本文建立的QSAR模型表明,2-氯苯酚與取代苯酚及苯胺類混合物對(duì)鯽魚的聯(lián)合毒性效應(yīng)主要與混合物的疏水性參數(shù)和電性參數(shù)有關(guān).-lg CL50mix與lg Pmix呈正相關(guān),表明混合物的脂溶性越強(qiáng),化合物分子越容易透過(guò)細(xì)胞膜分配到生物體內(nèi),因而毒性越強(qiáng).ΔE是表示分子相對(duì)硬度的指數(shù),常作為確定芳香系統(tǒng)穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn).化合物的ΔE值高表明其分子的穩(wěn)定性好,反應(yīng)性差;相反,ΔE值越低,表明電子從最高占有軌道遷移所需的能量越少,因此分子的反應(yīng)性越強(qiáng).而-lg C L50mix與ΔE mix呈負(fù)相關(guān),表明前沿軌道能距越小,電子越容易從最高占有軌道能躍遷到最低空軌道,混合物的反應(yīng)性越強(qiáng),毒性越大,這與Lu等[15,17]和Yan等[19]的研究結(jié)果相一致.

3 結(jié) 論

a.筆者測(cè)定了取代芳烴混合物對(duì)鯽魚的聯(lián)合毒性效應(yīng),采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合指數(shù)法評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的作用類型.2-氯苯酚與取代苯酚、苯胺類化合物等毒性聯(lián)合作用時(shí)毒性單位法和混合指數(shù)法的評(píng)價(jià)結(jié)果比較一致,聯(lián)合后主要表現(xiàn)為部分相加和協(xié)同作用.2-氯苯酚與2-氯苯胺不等毒性聯(lián)合時(shí)毒性單位法和相加指數(shù)法評(píng)價(jià)結(jié)果較一致,聯(lián)合后表現(xiàn)為拮抗作用.

b.以混合物的疏水性和親電性為結(jié)構(gòu)描述符,建立了聯(lián)合毒性效應(yīng)的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型.所得模型能較好地預(yù)測(cè)2-氯苯酚與取代苯酚及苯胺類混合物的聯(lián)合毒性,對(duì)取代苯酚和苯胺類二元及三元混合物的聯(lián)合毒性有一定的預(yù)測(cè)能力.

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