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    大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

    2012-10-09 03:03:56燕學波杜運華呂安林邢玉潔胡朝暉胡新君
    實用醫(yī)藥雜志 2012年10期
    關鍵詞:密度梯度離心法傳代

    燕學波,杜運華,呂安林,邢玉潔,胡朝暉,胡新君,岳 峰

    近幾年自體骨髓間充質干細胞(BMMSCs)移植技術發(fā)展迅速,逐漸成為治療心肌梗死后心衰的有效辦法之一。Frieden-stein于1966年首先證實BMMSCs是骨髓基質的重要組成成分,在一定條件下能向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化。骨髓是由造血干細胞和非造血干細胞組成,BMMSCs是骨髓的非造血干細胞,來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層,在體外可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等。BMMSCs因取材容易,不涉及倫理問題和無免疫排斥反應,被廣泛應用于各種動物實驗和臨床研究。但是目前尚未篩選出BMMSCs特征性的表面標記分子,因此無法直接鑒定BMMSCs。目前研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs表達間質細胞、內皮細胞、肌肉細胞等的一些表面標志抗原,而不表達造血干細胞的表面標志抗原。因此可以通過檢測BMMSCs陽性和陰性表面標志抗原的方法間接鑒定BMMSCs。主要的分離純化方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀篩選和免疫磁珠篩選。但是4種主要分離純化方法各有利弊,為此筆者提出,通過密度梯度離心法和貼壁法聯(lián)合分離純化BMMSCs,聯(lián)合細胞形態(tài)學變化和檢測傳代4代的BMMSCs表面陽性標志抗原CD44和表面陰性標志抗原CD45來鑒定BMMSCs。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 4周齡健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,體質量(120±20) g,SPF 級,由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供,實驗過程中對動物的處置符合倫理學標準。

    1.2 主要試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)液,胰蛋白酶,胎牛血清 (FBS),F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液 (1.077 g/ml),F(xiàn)ITC標記的抗大鼠 CD44,PE標記的抗大鼠CD45,超凈工作臺,二氧化碳細胞培養(yǎng)箱,光學倒置相差顯微鏡,高速室溫離心機,流式細胞儀。

    1.3 方法

    1.3.1 BMMSCs分離、培養(yǎng)及傳代 ①采用頸椎脫臼法處死大鼠,在超凈臺中用不完全培養(yǎng)液徹底沖洗大鼠骨髓腔,獲取骨髓懸液;用密度為1.077 g/ml的Ficoll淋巴細胞分離液離心分離出BMMSCs,加入適量L-DMEM完全培養(yǎng)液 (L-DMEM,10%FBS,300 mg/L L-Gln,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素),充分混勻,重懸、計數(shù),以1×106/ml的細胞密度接種于T25無菌塑料培養(yǎng)瓶,隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng),3 d后首次更換新鮮L-DMEM培養(yǎng)液,去除未貼壁的懸浮細胞,以后換液1次/3 d,并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,待原代細胞長滿培養(yǎng)瓶底85%左右時傳代;②待原代細胞接近85%融合時傳代,加入2.5 g/L的胰蛋白酶2~3 ml,將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察,待細胞間隙增大,回縮變圓時,立即棄去胰蛋白酶,加入適量L-DMEM培養(yǎng)液終止消化,按1∶2的比例將細胞懸液接種于L-DMEM培養(yǎng)基中,第3天首次換液,以后換液1次/3 d,傳代細胞記為P1,再次傳代細胞記為P2,培養(yǎng)至第4代,進行形態(tài)學觀察及表面標記抗原鑒定。

    1.3.2 BMMSCs的鑒定

    1.3.2.1 BMMSCs形態(tài)學變化 倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長情況并拍照記錄典型細胞形態(tài)。

    1.3.2.2 流式細胞儀鑒定 取第4代BMMSCs細胞,用PBS清洗之后加入胰蛋白酶進行消化,制成細胞懸液。將細胞懸液移入離心管中,室溫下1500 r/min,離心 5 min。用 PBS 洗滌 2 次,棄上清,余 50 μl,配成濃度為1×106/ml的細胞懸液。分別加入FITC標記的抗大鼠CD44單抗抗體2.5 μl,PE標記的抗大鼠 CD45 單抗抗體 5 μl,4 ℃,避光孵育 30 min。再次用PBS洗滌2次,棄上清液,加入300 μl的PBS,混勻細胞,制成單細胞懸液。將樣本上樣于流式細胞儀,檢測 FITC標記細胞和PE標記細胞各占細胞總數(shù)的百分比。

    1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理,結果以±s表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。

    2 結 果

    2.1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細胞形態(tài)學變化 在倒置顯微鏡下,剛接種的BMMSCs呈圓形或球形,體積小,折光性強(圖1a)。3 d后首次換液大部分細胞貼壁,體積較小,形態(tài)多樣,大部分細胞為橢圓形、短梭形,也有三角形和/或星形細胞,且伸出長短不一、粗細不等的胞質突起互相連接(圖1b)。7 d后,細胞快速增殖,形成大小不一的細胞集落,細胞數(shù)量明顯增多,體積增大,以長梭形為主,呈放射狀向四周擴展(圖1c)。傳代后細胞生長旺盛,呈長梭形、旋渦狀生長,且細胞形態(tài)均一,趨向一致(圖1d)。

    圖1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細胞形態(tài)變化

    2.2 BMMSCs表面抗原鑒定結果 對傳至第4代的BMMSCs進行鑒定,采用流式細胞儀檢測BMMSCs表面抗原CD44和CD45,結果顯示:BMMSCs CD44陽性表達率為(89.98±1.29)%,CD45陽性表達率為(2.14±0.22)%(圖2)。此結果與文獻報道一致。提示采用聯(lián)合法分離大鼠骨髓間充質干細胞,經過傳代培養(yǎng)擴增,可以得到純化的BMMSCs。

    3 討 論

    BMMSCs是骨髓中的非造血干細胞,主要來源于中胚層,在骨膜、肌肉和外周組織中均有存在,以骨髓和臍血中含量最多,但也只占骨髓有核細胞的0.001%~0.01%。因臍血涉及倫理學問題,且不易采取,故從骨髓中分離、純化和擴增BMMSCs就顯得非常重要[1,6]。 最初 Friedenstein[7]建立 BMMSCs 的分離方法是利用貼壁法分離得到。但隨著BMMSCs研究的深入,對細胞需求增加,快速獲得足夠的BMMSCs是各項研究的基礎。目前比較常用的分離純化方法是貼壁分離法和密度梯度離心法,流式細胞篩選和免疫磁珠分離法因操作繁瑣,且易損傷細胞,影響細胞的生物學功能而較少使用。

    圖2 BMMSCs表面抗原表達

    筆者通過充分沖洗大鼠骨髓腔獲取最大量骨髓后,用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法分離出單個核細胞,然后利用BMMSCs易于貼壁的特點,通過換液培養(yǎng)去除懸浮不貼壁的細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長,懸浮不貼壁的細胞隨換液而不斷被清除,而BMMSCs因貼壁生長得以純化。通過觀察BMMSCs形態(tài)學變化和流式細胞儀檢測BMMSCs表面陽性和陰性標志物來進行鑒定。從形態(tài)學上來鑒別:骨髓造血干細胞多呈圓形,而BMMSCs呈細長梭形,核大,且在培養(yǎng)傳代過程中,體積逐漸增大,并形成細胞集落,排列緊密,走向趨于均勻一致。在分離培養(yǎng)的BMMSCs中,雖然含有部分造血細胞,但因其不貼壁懸浮在培養(yǎng)液中,在換液時可以逐步去除,少量造血細胞也能貼壁,但增殖緩慢,在消化傳代時脫壁速度比BMMSCs慢,因此通過消化傳代的方法也可逐漸將其去除,傳至第4代基本可達到純化目的。

    另外一種方法就是通過流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原間接鑒定BMMSCs。目前研究BMMSCs 表達 CD29、CD44、CD71、CD105、CD166等,而不表達 CD14、CD31、CD34、CD45 等[2-5]。 朱勇等[8]采用直接貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs,通過流式細胞儀檢測BMMSCs表面標志抗原CD90、CD45進行鑒定,流式細胞儀檢測結果顯示第3代BMMSCs表面標記物CD90和CD45陽性表達率分別為99.8%和6.8%,提示BMMSCs表達CD90而不表達CD45。倪玉霞等[9]對全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs的純度進行比較,流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD34、CD44、CD45、CD29、CD90及CD11b。結果顯示兩種方法分離培養(yǎng)的BMMSCs均表達CD44、CD29和CD90,不表達CD34、CD45和CD11b。密度梯度離心法分離培養(yǎng)出的BMMSCs較全骨髓貼壁培養(yǎng)法純度高,但全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠縮短原代細胞培養(yǎng)時間,提高效率。Zhang等[10]將分離的大鼠BMMSCs利用表面抗原CD54和CD90進行免疫磁珠分選,經流式細胞儀檢測證實可以獲得高表達CD54和CD90,而不表達CD45的高純度的BMMSCs。也有研究者采用檢測細胞基因的方法來鑒定BMMSCs[11]。

    筆者選擇檢測BMMSCs陽性標志抗原CD44和陰性標志抗原CD45相結合的方式進行鑒定,其結果顯示BMMSCs CD44陽性表達率為 (89.98±1.29)%,CD45陽性表達率為(2.14±0.22)%。 此結果與相關文獻報道一致。提示采用密度梯度離心法和貼壁分離法聯(lián)合分離純化大鼠BMMSCs,經過傳代培養(yǎng)擴增,可以得到純化的BMMSCs。

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