Cx36在癲持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元的表達(dá)

戴珍祥 高志偉

1）南京市六合區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南京 211500 2）南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南通 226000

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：健康雄性SD大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共36只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，隨機(jī)分為生理鹽水組、喹啉組、辛醇組，每組12只大鼠。

1.1.2 試劑與儀器：氯化鋰、匹羅卡品、喹啉、辛醇（美國(guó)Sigma公司）；兔抗大鼠Cx36多克隆抗體、熒光標(biāo)記Cx36抗體（北京博奧生生物技術(shù)公司）；二抗（碧云天生物技術(shù)公司）；冰凍切片機(jī)，正置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；電泳儀（美國(guó)Bio－Rad公司）。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與處理：氯化鋰－匹羅卡品誘導(dǎo)的癲大鼠模型是參照Glien［4］提出的方法，稍作改良后建立的。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，觀察大鼠飲食活動(dòng)正常后稱(chēng)重，將大鼠腹腔注射氯化鋰125mg／kg預(yù)處理，間隔18～24h后給予匹羅卡品60mg／kg腹腔注射，30min后觀察大鼠癲發(fā)作程度，達(dá)到Racine評(píng)分4級(jí)及以上的大鼠進(jìn)入癲持續(xù)狀態(tài)（SE）。模型制備成功30min后分別予以各組大鼠腹腔注射喹啉（60mg／kg）、辛醇（60mg／kg）及等量生理鹽水。

1.2.2 Racine評(píng)分：根據(jù) Racine［5］制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷是否有癲發(fā)作行為：0級(jí)（0分），無(wú)任何癲發(fā)作；1級(jí)（1分），嘴及面部陣攣，咀嚼，哈欠；2級(jí)（2分），1級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)點(diǎn)頭，面部抽搐，頸部肌肉抽動(dòng)；3級(jí)（3分），2級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢或后肢抽搐；4級(jí)（4分），3級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立，身體突然立起；5級(jí)（5分），4級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)四肢節(jié)律性抽動(dòng)，下肢強(qiáng)直伴全身背曲或抽動(dòng)，跌倒。分別對(duì)各組癲持續(xù)狀態(tài)大鼠模型及給藥后30min、1h、2h及3h時(shí)進(jìn)行Racine評(píng)分。

1.2.3 Cx36表達(dá)檢測(cè)：各組大鼠分別于給藥后2h進(jìn)行海馬Cx36表達(dá)檢測(cè)。（1）免疫熒光方法：用3.5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，左心室插管，剪開(kāi)右心耳，先快速灌入溫生理鹽水100mL至血液沖凈，隨后灌入4%多聚甲醛500mL固定。灌注固定后開(kāi)顱取腦，4%甲醛浸泡，蔗糖梯度脫水，冰凍切片機(jī)切片，山羊血清封閉過(guò)夜，0.1%PBS洗滌后予以4℃條件下孵育熒光標(biāo)記抗體過(guò)夜，再次洗滌后貼腦片、甘油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察海馬Cx36的變化。（2）Western－blot方法：將大鼠急性斷頭，在冰上取出腦組織，秤取100mg海馬組織在1000μL蛋白裂解液加10μL蛋白酶抑制劑中勻漿，充分混勻后高速離心沉淀，取上清液，通過(guò)BCA法測(cè)出蛋白濃度。按每上樣孔60 μg蛋白上樣量計(jì)算出上樣容積，上樣至已制備好的10%分離膠板上樣孔里，以恒壓110V1.5h及恒流350mA 2h分別進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，然后牛奶封閉2h、一抗4℃孵育過(guò)夜、二抗室溫2h孵育、Ecl發(fā)光、暗房顯影定影，應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值，表示相對(duì)含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，用藥前后行為學(xué)評(píng)分差異應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠Racine評(píng)分比較見(jiàn)表1，生理鹽水組大鼠給藥前后Racine評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。喹啉組及辛醇組大鼠給藥前后Racine評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與生理鹽水組比較，給藥后喹啉組及辛醇組Racine評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表1 各組大鼠Racine評(píng)分比較 （s，分）

表1 各組大鼠Racine評(píng)分比較 （s，分）

注：與給藥前比較，＊P＜0.01；與生理鹽水組比較，△P＜0.01

組別 n 給藥前30min 給藥后30min 給藥后1h 給藥后2h 給藥后3h生理鹽水組 12 4.21±0.18 4.63±0.18 4.75±0.16 4.50±0.19 4.25±0.16喹啉組 12 4.32±0.25 1.13±0.14﹡△ 2.00±0.27﹡△ 0.88±0.12﹡△ 0.75±0.15﹡△辛醇組 12 4.29±0.27 1.25±0.23﹡△ 2.13±0.35﹡△ 1.00±0.15﹡△ 0.88±0.23﹡△

2.2各組大鼠海馬組織Cx36表達(dá)比較見(jiàn)表2。

2.2.1 應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬Cx36陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)：通過(guò)免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)各組均有Cx36陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，生理鹽水組Cx36陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 生理鹽水組海馬神經(jīng)元C×36表達(dá) A 10×10、B 10×20、C 10×40

圖2 喹啉組海馬神經(jīng)元C×36表達(dá) D 10×10、E 10×20、F 10×40

圖3 辛醇組海馬神經(jīng)元C×36表達(dá) G10×10、H10×20、I10×40

2.2.2 應(yīng)用 Western－blot方法檢測(cè)大鼠海馬Cx36含量的變化：見(jiàn)圖4。通過(guò) Western－blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組均有Cx36蛋白，生理鹽水組明顯高于喹啉組及辛醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠海馬神經(jīng)元C×36表達(dá)變化 a：生理鹽水組，b：喹啉組，c：辛醇組

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元Cx36表達(dá)比較（s）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元Cx36表達(dá)比較（s）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.01

組別 n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)／mm2）灰度比生理鹽水組12 82.53±0.32 0.56±0.003喹啉組 12 27.34±0.18﹡ 0.21±0.004﹡辛醇組 12 26.24±0.29﹡ 0.24±0.005﹡

與生理鹽水組比較，喹啉組及辛醇組大鼠海馬Cx36表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而后2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

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