杜仲不同提取部位對離體血管舒張作用的研究*

王 虹，瞿晶田，趙 鑫，郭 英，劉二偉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津 300193）

杜仲不同提取部位對離體血管舒張作用的研究*

王 虹1，2，瞿晶田1，趙 鑫2，郭 英2，劉二偉1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津 300193）

[目的]尋找杜仲中具有血管舒張作用的提取部位。[方法]分離得到杜仲11個提取部位，采用大鼠胸主動脈環(huán)實驗觀察各提取部位的血管舒張作用。[結(jié)果]在11個組分中只有組分6和11（終濃度0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mg/mL）可濃度依賴性舒張去甲腎上腺素收縮的離體血管。[結(jié)論]杜仲提取部位6和11富含杜仲中舒張血管的有效成分。

杜仲；提取部位；血管舒張

杜仲為杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.的樹皮，是名貴滋補藥材，具有補肝腎，強筋骨，安胎，降壓之功效，在臨床上應(yīng)用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、高血壓等[1]。杜仲降壓的作用一直是人們研究的熱點。血管舒張可以使總外周阻力下降，血壓進(jìn)而降低。已經(jīng)有研究證實，杜仲水提物具有血管舒張的作用[2-3]，然而水提物質(zhì)量可控性差，影響療效。因此應(yīng)用現(xiàn)代的分離方法，在粗提物中尋找藥效化學(xué)物質(zhì)基本清楚、質(zhì)量可控的杜仲提取部位或組分，對于提高杜仲降壓療效以及開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物具有重要意義。因此，本研究通過體外大鼠胸主動脈環(huán)實驗?zāi)Ｐ?，對杜?1個不同的提取部位進(jìn)行研究，以期尋找杜仲中具有良好血管舒張作用的部位或組分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量250～300g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。

1.2 杜仲不同提取部位的制備方法 將500g藥材加水置于10 L圓底燒瓶中以煎煮法回流提取2h，以紗布過濾，收集提取液。藥渣重新以8倍量溶劑再次回流提取2h，過濾后收集提取液。合并兩次

提取液進(jìn)行減壓蒸餾，將提取液濃縮至850mL左右。量取50mL提取液濃縮后干燥得樣品（1），其余800mL提取液進(jìn)行后續(xù)處理。

其余800mL提取液加入95%乙醇約2250mL進(jìn)行醇沉淀（最終醇濃度70%），充分?jǐn)嚢韬箪o置30min。所得混懸物經(jīng)離心（4000 r/min，離心10min）后得沉淀，沉淀真空干燥后記作樣品（2），上清液減壓蒸餾除去乙醇后濃縮至550mL，量取50mL蒸干并真空干燥得樣品（3），其余500mL進(jìn)行后續(xù)操作。

醇沉后溶液分別以等量石油醚、乙酸乙酯萃取3次，分別合并提取液，得到石油醚萃取樣品（4）、石油醚萃取母液樣品（5）及乙酸乙酯萃取樣品（6）、乙酸乙酯萃取母液樣品（7）。石油醚萃取母液樣品（5）、乙酸乙酯萃取母液樣品（7）分別取50mL真空干燥得樣品（5）、（7），石油醚萃取樣品（4）、乙酸乙酯萃取樣品（6），濃縮后干燥得樣品(4)、(6)。

稱取400g大孔樹脂制成大孔吸附樹脂色譜柱，將乙酸乙酯萃取后母液（7）溶液上樣完畢后靜置4h使樹脂柱充分吸附，分別以水、20%、70%、95%乙醇梯度洗脫，洗脫劑分別為2倍柱體積約1200mL，收集洗脫液分別蒸干后真空干燥得到樣品（8）、（9）、（10）、（11）。

1.3 主要試劑 去甲腎上腺素（NE），乙酰膽堿（ACH）（美國Sigma公司），氯化鈉（NaCl），氯化鉀（KCl），磷酸二氫鉀（KH2PO4），七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O），碳酸氫鈉（NaHCO3），葡萄糖（C6H12O6），氯化鈣（CaCl2）（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）。

1.4 實驗儀器 Maclab AID生物記錄軟件（澳大利亞Powerlab公司），Radnoti組織器官灌流系統(tǒng)（美國Powerlab公司）。

1.5 實驗方法 參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行。斷頭處死大鼠，迅速開胸，分離剪取胸主動脈，置于預(yù)冷的Krebs液中，小心去除血管周圍結(jié)締組織，剪成3～4 mm的血管環(huán)。若去內(nèi)皮，用玻璃棒輕輕碾壓血管。將處理好的動脈環(huán)一端固定于洗浴槽，另一端連接張力換能器，動脈環(huán)應(yīng)處于松弛狀態(tài)，固定好后調(diào)整動脈環(huán)張力至0.5g，置于不斷充入95%O2和5%CO2混合氣體的10mL的Krebs液中，水浴溫度為37℃，持續(xù)15min。換液，基線上調(diào)0.5g，持續(xù)15min，再換液，再上調(diào)，直至動脈環(huán)張力到2.0g。動脈環(huán)穩(wěn)定不小于90min，待穩(wěn)定后正式實驗。

首先加入高鉀母液使鉀離子終濃度達(dá)到60 mmol/L，刺激血管收縮（8～10min），換液，加入10mL的Krebs液，平衡到2.0g(15min)。加入NE（終濃度10-6mol/L）刺激血管收縮（8min），然后加入ACH（終濃度為10-5mol/L）作用8min，證明血管內(nèi)皮是否存在，換液，加入10mL的Krebs液，平衡到2.0g(15min)。加入NE（終濃度10-6mol/L）刺激血管收縮（8min），然后加入受試藥物（各作用時間為8min），記錄血管張力曲線。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 杜仲不同提取部位固形物收率 杜仲不同提取部位固形物收率見表1。

表1 固形物收率Table 1 The recovery rate

2.2 組分6對離體血管的舒張作用 組分6（0．4、0．8、1．2、1．6、2．0mg/mL）可濃度依賴性舒張去甲腎上腺素收縮的離體血管，累積加入組分6后血管的收縮率與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），見圖1和表2。

表2 組分6對去甲腎上腺素收縮的離體大鼠胸主動脈的舒張作用（±s）Tab.2 Vasorelaxation effect of constituents 6 in aortic rings precontracted with norepinephrine（±s）

表2 組分6對去甲腎上腺素收縮的離體大鼠胸主動脈的舒張作用（±s）Tab.2 Vasorelaxation effect of constituents 6 in aortic rings precontracted with norepinephrine（±s）

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

收縮率（%）0.4mg/m L組分6 0.8mg/m L組分6 1.2mg/m L組分6 1.6mg/m L組分6 2.0mg/m L組分6空白對照組 6 106.32±2.51 115.32±7.99 112.36±10.78 102.83±11.48 90.48±14.38加藥組 4 96.52±2.02** 89.63±2.06** 79.78±3.16** 70.92±4.61** 59.72±9.34**組別 n

2.3 組分11對離體血管的舒張作用 組分11（0．4、0．8、1．2、1．6、2．0mg/mL）可濃度依賴性舒張去甲腎上腺素（NE）收縮的離體血管，累積加入組分11后血管的收縮率與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），見圖2和表3。

3 討論

杜仲的化學(xué)成分研究已有大量報道，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)杜仲中降壓成分大致分為4類：木脂素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類。這些成分通過作用于不同的靶點共同發(fā)揮降壓的作用[6]。因此發(fā)揮中藥多成分協(xié)同作用的優(yōu)勢，尋找杜仲中具有良好降壓作用的部位和組分極具應(yīng)用價值。

表3 組分11對去甲腎上腺素收縮的離體大鼠胸主動脈的舒張作用（±s）Tab.3 Vasodilation effect of constituents 11 in aortic rings contracted with norepinephrine（±s）

表3 組分11對去甲腎上腺素收縮的離體大鼠胸主動脈的舒張作用（±s）Tab.3 Vasodilation effect of constituents 11 in aortic rings contracted with norepinephrine（±s）

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

收縮率（%）0.4mg/m L組分11 0.8mg/m L組分11 1.2mg/m L組分11 1.6mg/m L組分11 2.0mg/m L組分11空白對照組 6 106.32±2.51 115.32±7.99 112.36±10.78 102.83±11.48 90.48±14.38加藥組 4 96.58±4.41** 91.10±4.05** 77.99±2.74** 66.97±4.00** 51.10±6.37**組別 n

本研究對杜仲水煎液通過不同處理方法得到11個不同的提取部位，采用大鼠胸主動脈環(huán)實驗觀察其舒張血管作用。NE是強α受體激動劑，激活血管平滑肌細(xì)胞α受體以后，一方面開放受體操縱性鈣通道，促使細(xì)胞外鈣內(nèi)流，另一方面通過激活I(lǐng)P3信號通路釋放細(xì)胞內(nèi)鈣，兩者共同促發(fā)細(xì)胞的收縮效應(yīng)。研究結(jié)果表明，在杜仲的11個提取部位中，提取部位6和提取部位11可濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮的血管環(huán)，顯示出較好的血管舒張作用，而其余提取部位作用不明顯，提示此兩個部位富集了杜仲中直接作用于血管細(xì)胞的降壓成分。

在以后的研究工作中，筆者將以上述兩種組分為研究對象，對其化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離，建立定性和定量的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并且對其發(fā)揮作用的機制和藥代動力學(xué)等進(jìn)行深入的研究，為中藥的現(xiàn)代化提供理論依據(jù)。

[1]高學(xué)敏.中藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2002:520-521.

[2]Kwan CY,Chen CX,Ddyama T,et al.Endothelium dependent vasorelaxant effects of the aquenous extracts of the Eucommia ulmoidesn Oliv.leaf and bark:imp lications on their antihypertensive action[J].Vascul Pharmacology,2003,40(5):229-235.

[3]Kwan CY,Zhang WB,Deyama T,et al.End thelium dependent vascular relaxation induced by Eucommia ulmoides Oliv.bark extract is mediated by NO and EDHF in small vessels[J].Naunyn Schmied ebergs Arch Pharmacol,2004,369(2):206-211.

[4]Tep-areenan P,Sawasdee P,Randall M.Possible Mechanisms of Vasorelaxation for 5,7-Dimethoxyflavone from Kaempferia parviflora in the Rat Aorta[J].Phytother.Res,2010,24:1520-1525.

[5]Xue YL,Shi HX,Muradd,et al.2011.Vasodilatory effects of cinnamaldehyde and its mechanism of action in the rat aorta[J].Vascular Health and Risk Management,2011,7:273-280.

[6]羅麗芳，吳衛(wèi)華，歐陽冬生，等．杜仲的降壓成分及降壓機制[J].中草藥，2006，37（1）：150－152．

Effects of fractions at different part of Eucommia ulmoides on the vascular relaxation in vitro

WANG Hong1,2,QU Jing-tian1,ZHAO Xin2,GUO Ying2,LIU Er-wei1
（1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Chinese Medical Pharmacology,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To find out the fraction of Eucommia ulmoides possessing the best effect of vascular relaxation[Methods]The aortic ring of rats was used as the experiment model to investigate the vascular relaxation effect of different fractions in Eucommia ulmoides.[Result]The fraction 6 and 11(final concentration 0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mg/mL)showed a good vasodilation effect in aortic rings precontracted with norepinephrine.[Conclusion]Fraction 6 and 11 enrich the constituents which has good vasodilation effect in Eucommia ulmoides.

Eucommia ulmoides;constituents;vasodilation

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0381-03

2012-03-28）

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃項目（11JC ZDJC21100）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81173592）。

王 虹（1974－），女，博士，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。

王 虹。