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    骨碎補(bǔ)外用對環(huán)磷酰胺致小鼠斑禿模型的影響*

    2012-09-26 11:47:44黃云英張德芹王雪妮王元元
    天津中醫(yī)藥 2012年4期
    關(guān)鍵詞:米諾地爾環(huán)磷酰胺毛囊

    黃云英,張德芹,沈 麗,王雪妮,杜 娟,王元元

    (天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300193)

    骨碎補(bǔ)外用對環(huán)磷酰胺致小鼠斑禿模型的影響*

    黃云英,張德芹,沈 麗,王雪妮,杜 娟,王元元

    (天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300193)

    [目的]考察骨碎補(bǔ)外用對環(huán)磷酰胺致C57BL/6小鼠斑禿模型的影響。[方法]采用環(huán)磷酰胺腹腔注射建立C57BL/6小鼠斑禿模型,觀察骨碎補(bǔ)外用對小鼠毛囊組織學(xué)變化和血清細(xì)胞間黏附蛋白(ICAM-1)、內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞黏附分子-1(ELAM-1)水平的影響。[結(jié)果]骨碎補(bǔ)外用能使實(shí)驗(yàn)性斑禿模型小鼠血清ICAM-1和ELAM-1水平降低,毛囊數(shù)增多(P<0.05或P<0.01)。[結(jié)論]骨碎補(bǔ)外用能夠抑制毛囊進(jìn)入退行期,對斑禿模型小鼠具有治療作用。

    骨碎補(bǔ);外用;環(huán)磷酰胺;斑禿

    骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze)J.Sm.的干燥根莖。其味苦,性溫。歸肝、腎經(jīng)。《本草綱目》中記載骨碎補(bǔ)治病后發(fā)落:“胡孫姜(骨碎補(bǔ))、野薔薇嫩枝煎汁,刷之?!盵1]但其所治“病后發(fā)落”與“斑禿”是否有相關(guān)性有待深入考證。2010年版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)記載骨碎補(bǔ)“外治斑禿”[2],但相關(guān)藥理作用研究卻仍處于起步階段,其作用靶點(diǎn)及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脫發(fā)模型觀察骨碎補(bǔ)外用對毛發(fā)生長周期和血清中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞黏附分子-1(ELAM-1)水平的影響,考察骨碎補(bǔ)外用對斑禿模型動物的治療作用,為《中國藥典》完善骨碎補(bǔ)“外治斑禿”功能提供藥效學(xué)參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥物 骨碎補(bǔ)藥材購于安徽亳州藥材市場,由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李天祥老師鑒定,批號為2011032。注射用環(huán)磷酰胺,0.2g/瓶,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品,批號為11061821,實(shí)驗(yàn)前用注射用生理鹽水配成所需濃度。2%米諾地爾擦劑為天津市長征醫(yī)院產(chǎn)品,批號為20110809。ICAM-1試劑盒、ELAM-1試劑盒均為上海藍(lán)基生物科技有限公司產(chǎn)品,批號均為20111114。

    1.2 儀器 TD10001電子天平(天津市天馬儀器廠),Infinite M200微量多功能讀板機(jī)(瑞士TECAN公司),BMJ-1生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司),RM2135切片機(jī)(德國LEICA公司),BX41研究級正置顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

    1.3 動物 C57BL/6小鼠,8周齡,雄性,體質(zhì)量(20±2)g,由北京市華阜康實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供,動物許可證號為SCXK(京)2009-0004。

    1.4 方法

    1.4.1 骨碎補(bǔ)提取 骨碎補(bǔ)藥材550g,粉碎,用60%乙醇回流提取3次,每次1h,回收乙醇至240g。實(shí)驗(yàn)前用60%乙醇配成0.69g/g藥液。

    1.4.2 模型制備 按文獻(xiàn)方法[3],C57BL/6小鼠60只,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組,每組10只,即正常對照組、模型對照組、米諾地爾對照組、骨碎補(bǔ)高(2.4g/kg)、中(1.2g/kg)、低(0.6g/kg)劑量組。將小鼠用乙醚輕度麻醉后,用石蠟將其背部毛拔掉,誘導(dǎo)生長期毛囊改變,面積約為3cm×4cm。于拔毛后第9天,除正常對照組給等量生理鹽水外,其他各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg。

    1.4.3 給藥治療 從拔毛第2天開始,模型對照組小鼠外涂等體積60%乙醇,米諾地爾對照組外涂2%米諾地爾擦劑0.3mL/只,骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組外涂骨碎補(bǔ)醇提液2.4、1.2、0.6g生藥/kg,每日給藥1次,連續(xù)給藥18d,定時(shí)拍照觀察小鼠毛發(fā)脫落及生長情況。

    1.4.4 指標(biāo)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠摘除眼球取血,注入試管中靜置2h,離心(1000 r/min,20min),分離血清,采用雙抗體夾心ELISA法測定血清中ICAM-1和ELAM-1水平,操作參照試劑盒說明書。再取小鼠背部皮膚,10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木-伊紅素(HE)染色,觀察5個(gè)不重疊的視野,計(jì)算每視野平均毛囊個(gè)數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析,偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 背部拔毛區(qū)皮膚顏色變化 C57BL/6小鼠拔毛后第1~4天內(nèi),皮膚顏色呈粉紅色,未發(fā)生明顯變化,處于生長期早期;第5~6天,皮膚顏色逐漸變?yōu)榛疑?,進(jìn)入生長期第V亞期;第10~11天,各組小鼠背部拔毛區(qū)皮膚呈黑色并可見新長出的毛發(fā);注射環(huán)磷酰胺后4~5d,除正常組外各組小鼠頭部和背部毛發(fā)開始出現(xiàn)脫落;拔毛后第17~18天,正常對照組新長出的毛發(fā)已經(jīng)覆蓋整個(gè)脫毛區(qū),其余各組小鼠皮膚顏色開始變淺變灰,為退行性改變。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。

    2.2 組織學(xué)檢查 拔毛后第18天,組織學(xué)檢查各組小鼠毛囊形態(tài)有一定的差異。鏡檢可見正常鼠處于生長期,皮膚表皮較薄;模型對照組毛囊數(shù)目明顯減少,毛囊縮短,扭曲,毛囊下段退化,呈營養(yǎng)障礙性,毛囊色素生成障礙,毛囊管膨大,呈退行性改變,此外,可見皮膚表皮明顯增生,棘層和顆粒層增厚,細(xì)胞層數(shù)增多;米諾地爾對照組及骨碎補(bǔ)2.4g/kg劑量組小鼠毛囊數(shù)目接近正常鼠,毛囊較大、較長,多數(shù)仍為生長期。米諾地爾對照組和骨碎補(bǔ)2.4g/kg劑量組毛囊數(shù)與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

    2.3 血清ICAM-1和ELAM-1的檢測結(jié)果 見表2。模型對照組ICAM-1和ELAM-1水平提高,明顯高于正常對照組(P<0.05或P<0.01),給藥后血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低,米諾地爾對照組和骨碎補(bǔ)0.6g/kg劑量組ICAM-1水平與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),骨碎補(bǔ)2.4、1.2、0.6g/kg劑量組ELAM-1水平與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

    表1 骨碎補(bǔ)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠毛囊的影響(±s)Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide(±s)

    表1 骨碎補(bǔ)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠毛囊的影響(±s)Tab.1 Effects of Drynaria fortunei on folliculus pili of alopecia areata mice induced by cyclophosphamide(±s)

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

    組別 劑量(g/kg) 每視野毛囊數(shù)(個(gè))正常對照組 54.2±21.0**模型對照組 26.2±7.9米諾地爾對照組 0.3mL/只 44.8±15.3*骨碎補(bǔ)高劑量組 2.4 40.5±18.4*骨碎補(bǔ)中劑量組 1.2 31.4±16.5骨碎補(bǔ)低劑量組 0.6 28.7±12.8

    表2 骨碎補(bǔ)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影響(±s,n=10)Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice(±s,n=10)ng/m L

    表2 骨碎補(bǔ)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)斑禿模型小鼠血清ICAM-1、ELAM-1的影響(±s,n=10)Tab.2 Effects of Drynaria fortunei on serum ICAM-1 and ELAM-1 in mice with alopecia areata mice(±s,n=10)ng/m L

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

    組別 劑量(g/kg) ICAM-1 ELAM-1正常對照組 1.03±0.22* 1.07±0.21**模型對照組 1.37±0.40 1.53±0.50米諾地爾對照組 0.3mL/只 1.01±0.36* 1.36±0.39骨碎補(bǔ)高劑量組 2.4 1.32±0.23 1.04±0.18**骨碎補(bǔ)中劑量組 1.2 1.17±0.21 1.10±0.20*骨碎補(bǔ)低劑量組 0.6 0.77±0.21** 1.13±0.45*

    3 討論

    斑禿是在不可預(yù)見的情況下,在不固定區(qū)域發(fā)生的非創(chuàng)傷性毛發(fā)脫落,屬于中醫(yī)“油風(fēng)”、“鬼剃頭”的范疇,但病因至今未明。中醫(yī)認(rèn)為,氣血不足和失于調(diào)達(dá)是脫發(fā)的主要機(jī)制[5]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為先天性脫發(fā)屬常染色體隱性遺傳或其他缺陷,后天性脫發(fā)由某些全身性疾病頭部局部疾患及精神因素、遺傳、內(nèi)分泌障礙性疾病、機(jī)械性或化學(xué)刺激等多種因素造成[6]。其臨床表現(xiàn)往往是多種復(fù)雜因素相互作用的結(jié)果。斑禿的治療是個(gè)世界性的難題,治療斑禿的藥物研究也比較廣泛,從目前看主要為一些調(diào)節(jié)毛囊炎癥和促進(jìn)毛發(fā)生長的藥物。

    毛發(fā)生長經(jīng)歷生長期、退行期和休止期的周期性生長,通過皮膚的顏色可以簡單地判斷毛發(fā)周期的變化[7]。C57BL/6小鼠軀干皮膚的黑素細(xì)胞只存在于毛囊中,而且僅于生長期時(shí)合成黑素并傳遞給角質(zhì)形成細(xì)胞,使皮膚變?yōu)楹谏恢镣诵衅?,黑素生成減少,皮膚呈灰色;至休止期,黑素合成完全停止,皮膚變?yōu)榉奂t色。此過程受生長因子、細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)肽、藥物等多種體內(nèi)外因素調(diào)節(jié)。

    抗腫瘤藥物引起的毛發(fā)脫落是最常見的生長期禿發(fā),這些藥物在消滅迅速分裂的癌細(xì)胞的同時(shí),也攻擊毛囊四周迅速分裂的細(xì)胞,導(dǎo)致脫發(fā)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9],環(huán)磷酰胺能夠?qū)е旅壹?xì)胞凋亡,并明顯提高小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1和ELAM-1的水平,其可能通過調(diào)節(jié)小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1和ELAM-1表達(dá)水平而產(chǎn)生化療性脫發(fā)。在實(shí)驗(yàn)動物中,如果臨時(shí)可逆性地抑制ICAM-1和ELAM-1表達(dá),可以減輕抗癌治療中的毒性反應(yīng)。

    本實(shí)驗(yàn)采用8周齡的C57BL/6小鼠背部皮膚拔毛,誘導(dǎo)生長期毛囊的產(chǎn)生,然后于拔毛后第9天單劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg,成功誘導(dǎo)嚴(yán)重的毛發(fā)脫落,建立生長期禿發(fā)的動物模型,研究骨碎補(bǔ)外用對C57BL/6小鼠毛發(fā)生長周期的影響。通過組織學(xué)觀察到用藥組小鼠毛囊數(shù)較模型對照組增多,骨碎補(bǔ)外用能夠改善毛囊營養(yǎng),減少退行期毛囊內(nèi)細(xì)胞凋亡,抑制毛囊進(jìn)入退行期,可見骨碎補(bǔ)外用在一定程度上能夠?qū)弓h(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的毛發(fā)脫落。本研究還發(fā)現(xiàn),通過骨碎補(bǔ)治療后斑禿模型小鼠血清中ICAM-1和ELAM-1水平降低,但其促進(jìn)毛發(fā)生長的作用是否與其能夠降低血清中ICAM-1和ELAM-1水平有關(guān),還有待進(jìn)一步研究。

    [1]明·李時(shí)珍.本草綱目[M].北京:中醫(yī)古籍出版社,1994:593.

    [2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:239.

    [3]Paus R,Handjiski B,Eichmüller S,et al.Chemotherapy-induced alopecia in mice.Induction by cyclophosphamide,inhibition by cyclosporine A,and modulation by dexamethasone[J].Am J Pathol, 1994,144(4):719-734.

    [4]Slominski A,Paus R.Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesisinhairgrowth[J].JInvestDermatol,1993,101(1Suppl): 90S-97S.

    [5]閆秋虹,陳 宏.從氣血論脫發(fā)[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,29(4):175-176.

    [6]王惠華.中醫(yī)藥治療脫發(fā)[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1995,14(2):22.

    [7]Paus R,Handjiski B,Czarnetzki BM,et al.A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression(catagen):effects of dexamethasoneandcyclosporinA[J].JInvest Dermatol,1994,103(2): 143-147.

    [8]Jimenez JJ,Roberts SM,Mejia J,et al.Prevention of chemotherapyinduced alopecia in rodent models[J].Cell Stress and Chaperones, 2008,13(1):31-38.

    [9]刑 飛,姜 波,涂亞庭.環(huán)磷酰胺對小鼠血清和局部毛囊內(nèi)ICAM-1及ELAM-1水平的影響[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(4):314-317.

    Experimental effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in mice

    HUANG Yun-ying,ZHANG De-qin,SHEN Li,WANG Xue-ni,DU Juan,WANG Yuan-yuan
    (Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae,Institute of traditional Chinese medicine, Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China)

    [Objective]To investigate the effects of Drynaria fortunei on alopecia areata induced by cyclophosphamide in C57BL/6 mice.[Methods]Severe alopecia was induced by cyclophosphamide in these mice.The hair growth and histological changes were observed in the back skin of them.The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in the serum were determined by ELISA.[Results]The levels of ICAM-1 and ELAM-1 in herbal group were lower than that in the control group.The nutrition of hair follicles was also improved.[Conclusions]The extract from Drynaria fortunei has a promoting effect on the hair growth by its external application.

    Drynaria fortunei;external application;cyclophosphamide;alopecia areata

    R285.5

    A

    1672-1519(2012)04-0375-03

    2012-02-10)

    國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BA153B09)。

    黃云英(1985-),女,碩士研究生,主要研究方向?yàn)橹兴幓纠碚摷芭R床應(yīng)用。

    張德芹。

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