芥菜型油菜A9染色體黃籽基因區(qū)域BAC重疊群的構(gòu)建

王 卓，袁玉輝，胡學(xué)芳，劉顯軍，劉旭東，劉忠松

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

油菜是重要的油料作物，包括白菜型、芥菜型和甘藍(lán)型三種類型，這三種類型的油菜具有共同的白菜來源的A 基因組[1]。A9 染色體是A 基因組中最長的染色體，長約37 Mb。A9 染色體上有控制種子大小[2]、種皮顏色[3]、硫苷合成[4－5]、油脂合成[6]等重要性狀的基因。研究者對A9 染色體進(jìn)行了大量研究，定位了大量SSR 標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了許多基因[7-15]。Wang 等[16]公布了應(yīng)用新一代測序方法測定的白菜基因組序列，為將這些標(biāo)記、基因定位到A9 染色體對應(yīng)BAC 和Scaffold 提供了基礎(chǔ)。Mun 等[17]構(gòu)建了由67468 個(gè)BAC 克隆組成的第一張白菜全基因組物理圖譜，圖譜上有242 個(gè)分布在10 個(gè)連鎖群上的重疊群，長約717 Mb，對加速基因組序列分析、BAC 克隆序列的整合，以及蕓薹屬物種間的比較基因組研究起著重要的作用。

研究利用已構(gòu)建的ZBjH BAC 文庫，用A9 染色體上的標(biāo)記進(jìn)行PCR 步移篩選，構(gòu)建重疊群，并與已測序的白菜A9 染色體物理圖譜進(jìn)行比較，分析蕓薹屬植物A9 染色體的進(jìn)化和變異。構(gòu)建芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區(qū)域物理圖譜有助于黃籽候選基因的獲得，為芥菜型油菜與白菜（白菜型油菜）、甘藍(lán)型油菜A9 染色體進(jìn)行比較物理作圖提供基礎(chǔ)，并為A9 染色體遺傳圖譜的加密和分子育種提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材 料

以芥菜型油菜作圖群體親本紫葉芥作為構(gòu)建BAC 文庫材料，提取植物幼葉總DNA，用Hind III不完全酶切，然后將酶切片段插入改良過的pIndigoBAC536 克隆載體構(gòu)建芥菜型油菜BAC 文庫即ZBjH 文庫。ZBjH 文庫包含71 808（384×187）個(gè)BAC 克隆，經(jīng)用I-sceI 酶切后用脈沖場分離檢測，插入片段大小在50～190 kb 之間，平均插入片段大小為126.7 kb，空載率2.7%，相當(dāng)于芥菜型油菜1 068 Mb 基因組的8.7 倍。ZBjH BAC 文庫由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅美中教授實(shí)驗(yàn)室協(xié)助構(gòu)建。

1.2 方 法

主要用PCR 篩選法，利用遺傳圖的SSR 引物篩庫，篩到的BACs 進(jìn)行末端測序，然后將BAC 末端設(shè)計(jì)引物，篩選具有共同的核苷酸序列的BACs，對應(yīng)于同一遺傳位點(diǎn)的不同克隆必然擁有相同的核苷酸序列，表明它們的插入片段存在重疊區(qū)域，根據(jù)這一原理組建重疊群。

1.2.1 BAC 混合池構(gòu)建 建立了3 個(gè)水平的BAC DNA 池（一級池、二級池和三級池）。一個(gè)三級池由一個(gè)平板的一行48 個(gè)克隆的DNA 組成（如34 號平板的AB，CD……OP）；一個(gè)二級池由一個(gè)平板（含有384 個(gè)克?。┑腄NA 組成；一個(gè)一級池由連續(xù)10 個(gè)的二級池的DNA 混合而成（如1～10，11～20……181～187），共19 個(gè)一級池。

1.2.2 BAC 混合池篩選 用PCR 技術(shù)進(jìn)行油菜BAC DNA 文庫(含187 個(gè)平板，每個(gè)平板含384 個(gè)克隆)的篩選分4 步進(jìn)行。BAC DNA 文庫篩選的第一步是對19 個(gè)一級池的篩選；得到陽性一級池后(如18 號一級池)，對其所含的10 個(gè)二級池（從171～180）進(jìn)行第二步篩選；得到陽性二級池后，對其所含的8 個(gè)三級級池（如171 號的AB，CD，EF，GH，IJ，KL，MN，OP）進(jìn)行第三步篩選；得到陽性三級池后，對48 個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR（第四輪）篩選，得到單一陽性克隆。

1.2.3 測 序 將菌落PCR 篩選，得到的單一陽性克隆搖菌過夜，由華大基因公司測BAC 末端序列。

1.2.4 BAC 末端引物設(shè)計(jì)和文庫再篩選 得到的BAC 末端序列用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)BAC末端引物，BAC 末端引物命名方法是：BAC 的CMR/M13 端引物為BAC-L，而S1 端引物為BACR。用新設(shè)計(jì)的末端引物繼續(xù)篩選ZBjH BAC 文庫。

1.2.5 BAC 末端序列BLAST 分析 得到的BAC末端序列在http://brassicadb.org 上進(jìn)行序列比對，構(gòu)建BAC 重疊群。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAC 重疊群的構(gòu)建

從遺傳定位研究中發(fā)現(xiàn)的共分離標(biāo)記A9-88和A9-32 開始進(jìn)行ZBjH BAC 文庫篩選，A9-88 篩選到63-H-13、102-C-7、160-C-4、152-E-22、85-O-7 和110-H-12 等BACs，而A9-32 篩選到160-C-4 和31-O-21 2 個(gè)BACs。兩個(gè)標(biāo)記均篩選到BAC 160-C-4，測BAC 末端序列，通過設(shè)計(jì)BAC末端引物160C4L/R 繼續(xù)篩選BAC 文庫，向兩端進(jìn)行延伸。

試驗(yàn)共篩選出BAC752 個(gè)，末端測序395 個(gè)，得到BAC 末端序列674 條，設(shè)計(jì)BAC 末端引物533 對，構(gòu)建了芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區(qū)域長約2.2 Mb 的BAC 重疊群，見圖1。

圖1 芥菜型油菜黃籽基因區(qū)域種子BAC 重疊群

此種子BAC 重疊群，左起B(yǎng)AC 末端標(biāo)記124J24R，右至BAC 末端標(biāo)記171J1L，圖1 展示26個(gè)BAC 和64 個(gè)標(biāo)記，其中SSR 標(biāo)記10 個(gè)，BAC 末端標(biāo)記49 個(gè)，根據(jù)白菜序列設(shè)計(jì)的STS 標(biāo)記5 個(gè)。

有的標(biāo)記本該篩選到BAC，卻未能篩選到，如標(biāo)記122I23L 未能篩選到BAC 68-D-18，但通過測序BAC 68-D-18，將其全長序列與標(biāo)記122I23L 的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)能比對上，說明BAC 68-D-18上有一段序列與標(biāo)記122I23L 相同，應(yīng)該可以被篩選到。出現(xiàn)這種情況的可能原因有：①建BAC DNA四級池時(shí)，由于提取高純度的質(zhì)粒DNA 難度較大，有的BAC 質(zhì)粒DNA 濃度較低，PCR 篩選時(shí)未篩選到。②PCR 技術(shù)的原因，PCR 分4 步進(jìn)行篩選時(shí)，可能漏篩。有的標(biāo)記如184E24R 不能篩選到BAC 154-P-5，可能原因是：引物184E24R 是在重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)的，能與多條序列比對上，因此，此標(biāo)記不可靠，棄之。在圖中挑選這26 個(gè)種子BACs 構(gòu)建重疊群時(shí)，遵循的原則有兩點(diǎn)：（1）盡可能多的標(biāo)記能篩選到它；（2）標(biāo)記序列不是重復(fù)序列。這樣出現(xiàn)假陽性BAC 克隆的幾率較小。

2.2 物理圖譜比較

根據(jù)BAC 末端序列與白菜序列的比對結(jié)果和白菜、甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，對白菜、甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區(qū)域支架（Scaffolds）序列排序進(jìn)行比較，見圖2。

圖2 芥菜型油菜與白菜型、甘藍(lán)型油菜物理圖譜比較

試驗(yàn)中構(gòu)建的BAC 重疊群，定位在芥菜型油菜A9 染色體標(biāo)記A9-121到A9-351之間，涵蓋了Scaffold000040的一部分，Scaffold000185、Scaffold 000059、Scaffold0000169、Scaffold000135 和Scaff-old000102 的全部以及Scaffold000066的一部分，白菜A9染色體Scaffold000040、Scaffold000185、Scaffold000059、Scaffold0000169、Scaffold000135、Scaffold000102 及Scaffold000066 的長度分別為：1.87 Mb、207 kb、1.34 Mb、280 kb、460 kb、837 Kb及1.31 Mb，通過估算，研究構(gòu)建的BAC重疊群約為2.2 Mb。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜A9 染色體支架（Scaffolds）序列排序與白菜、甘藍(lán)型油菜都有不同，如圖2 所示：Bancroft 等[18]認(rèn)為白菜該區(qū)域附近的支架排序是：從左至右依次是000040 號支架、000059 號支架、000066 號支架、000022 號支架，而甘藍(lán)型油菜在000040 號支架和000059 號支架之間正向插入了Scaffold000185 號支架，在000059 號支架和000066 號支架之間正向插入000135 號支架和反向插入000102 號支架，而筆者研究發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜與白菜不同之處除了跟甘藍(lán)型油菜一樣正向插入000185 號支架和000135 號支架、反向插入000102 號支架外，還在000059 號支架和000135 號支架之間反向插入了約280 kb 的000169 號支架。這說明在芥菜型油菜進(jìn)化過程中，A9 染色體序列也發(fā)生了插入、易位等結(jié)構(gòu)重排，而且這種結(jié)構(gòu)重排與甘藍(lán)型油菜并不完全相同。

3 結(jié) 論

構(gòu)建了芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區(qū)域長約2.2 Mb 的BAC 重疊群，為PCR 步移篩選法構(gòu)建BAC 重疊群建立了方法，同時(shí)發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜該區(qū)域DNA 序列與白菜、甘藍(lán)型油菜都有較大差異。由于該區(qū)域可能處在著絲粒附近，序列高度重復(fù)，構(gòu)建難度較大，要想將此重疊群向兩端繼續(xù)擴(kuò)大，需綜合特異性探針的雜交、PCR 篩選、酶切指紋分析、BAC 克隆STC 延伸、BAC 末端測序等多種方法。

[1]劉忠松，王 卓，劉顯軍，等.2012 油菜A9 染色體的標(biāo)記、基因和結(jié)構(gòu)變異[EB/OL].http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/201203-55.

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