普洱茶對(duì)apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

程春華 楊繼紅 (昆明醫(yī)學(xué)院暨天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室毒性病理室，云南 昆明 650031)

載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠是研究動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施較理想的動(dòng)物模型，是篩選抗AS藥物的良好實(shí)驗(yàn)平臺(tái)〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)探討普洱茶對(duì)apoE(-/-)小鼠高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的影響。以期為普洱茶防治遺傳因素相關(guān)的高脂血癥和AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只apoE基因敲除小鼠，8周齡，體重(20±2)g，雄性，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為4組，即動(dòng)脈粥樣硬化模型組、血脂康組、普洱生茶組、普洱熟茶組，每組各10只。10只相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠，8周齡，體重(20±2)g，雄性，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院，為陰性對(duì)照組。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，自由飲水，SPF級(jí)全價(jià)營(yíng)養(yǎng)鼠料。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥 正常對(duì)照組及AS模型組每天均給予蒸餾水0.4 ml灌胃，普洱生茶組和普洱熟茶組則根據(jù)成人每日推薦飲茶劑量的10倍換算為小鼠的給藥劑量為30 mg·kg－1·d－1。血脂康組根據(jù)成人臨床推薦給藥劑量換算成小鼠給藥劑量為10 mg·kg－1·d－1連續(xù)灌胃12 w。每周記錄體重1次，根據(jù)體重，調(diào)整給藥劑量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每組小鼠在移動(dòng)性、行為和攝食方面無(wú)明顯差別。

1.3 血脂的測(cè)定 動(dòng)物禁食12 h后，犧牲動(dòng)物，取靜脈血2～3 ml，3 000 r/min×10 min離心，取血清上樣于全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量并計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)。

1.4 hs-CRP的測(cè)定 血脂檢測(cè)完畢后，剩余血清檢測(cè)血中炎癥標(biāo)志物，按試劑盒操作步驟，小鼠hs-CRP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R＆D公司。

1.5 主動(dòng)脈病變的形態(tài)學(xué)觀察 動(dòng)物采血后處死，摘取自心臟至髂總動(dòng)脈分叉處主動(dòng)脈全段，主動(dòng)脈根部近心端1.0 cm切下，放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定〔3〕。切片厚度為3 μm，進(jìn)行HE染色，普通光鏡觀察形態(tài)學(xué)改變，顯微鏡-微機(jī)彩色圖像處理系統(tǒng)測(cè)量相關(guān)病理指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平 見(jiàn)表1。模型組血脂水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，各藥物組均明顯改善(P＜0.05)。

2.2 各組AI(%)比較 正常對(duì)照組為(0.3±0.15)，AS模型組為(4.7±0.76)，普洱生茶組為(2.8±0.6)，普洱熟茶組為(3.0±0.46)，血脂康組為(2.6±1.68)。模型組較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)。各用藥組較模型組明顯改善(P＜0.05)。

2.3 血清hs-CRP(mg/L)水平 正常對(duì)照組為(0.5±0.02)，AS模型組為(0.8±0.04)，普洱生茶組為(0.7±0.03)，普洱熟茶組為(0.7±0.01)，血脂康組為(0.6±0.01)。模型組 hs-CRP水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，各用藥組較模型組均明顯改善。

表1 普洱茶對(duì)apoE基因敲除小鼠AS試驗(yàn)中血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比較(± s，n=10，mmol/L)

表1 普洱茶對(duì)apoE基因敲除小鼠AS試驗(yàn)中血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比較(± s，n=10，mmol/L)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與AS模型組比較:2)P＜0.05

組別TG TC LDL-C HDL-C正常對(duì)照組0.7±0.30 2.60±0.39 0.60±0.32 1.9±0.17 AS模型組 2.2±0.851)45.4±6.351)37.2±6.051)7.9±1.081)普洱生茶組 0.9±0.202)23.1±2.872)17.0±2.872)6.1±1.072)普洱熟茶組 0.8±0.352)21.7±3.992)16.4±3.592)5.3±0.422)血脂康組 1.2±0.562)16.2±7.012)12.0±6.052)4.2±1.122)

2.4 主動(dòng)脈病理學(xué)檢查 飼養(yǎng)12 w后，正常對(duì)照組主動(dòng)脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜和外膜未見(jiàn)異常;內(nèi)膜完整，未見(jiàn)泡沫細(xì)胞聚集，無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化病變形成。模型組主動(dòng)脈壁AS各期病變均可見(jiàn)，可見(jiàn)由大量泡沫細(xì)胞形成的脂紋脂斑期病變，也可見(jiàn)由纖維帽覆蓋的纖維斑塊期病變及由大量泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶形成的粥樣斑塊期病灶，且斑塊較厚，纖維帽較薄，脂質(zhì)核心較大，泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶較多，與管壁黏附不緊密，有脫落，內(nèi)膜完整性破壞，大量泡沫細(xì)胞形成和堆積，突向管腔，主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞下和中膜間隙明顯增寬，動(dòng)脈管壁厚薄不均，內(nèi)膜明顯增厚，外膜可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，形成明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。而普洱生茶組與普洱熟茶組動(dòng)脈粥樣硬化程度與AS模型組相比明顯減輕，多為早期粥樣硬化，管壁可見(jiàn)輕度隆起和增厚，泡沫細(xì)胞聚集程度較AS模型組減輕、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和斑塊數(shù)量較AS模型組少。見(jiàn)圖1，圖2。

2.5 主動(dòng)脈粥樣斑塊面積定量分析 見(jiàn)表2。

2.6 主動(dòng)脈損傷病變程度的比較 見(jiàn)表3。

圖1 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠AS主動(dòng)脈病理圖片(HE，×20)

表2 普洱茶抗apoE基因敲除AS小鼠主動(dòng)脈斑塊面積定量分析

表3 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化試驗(yàn)主動(dòng)脈損傷病變程度

圖2 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈病理圖片(HE，×40)

2.7 主動(dòng)脈粥樣斑塊數(shù)量分析 apoE(+/+)對(duì)照組斑塊數(shù)量0個(gè);apoE(-/-)對(duì)照組斑塊數(shù)量15個(gè);apoE(-/-)普洱生茶組斑塊數(shù)量12個(gè);apoE(-/-)普洱熟茶組斑塊數(shù)量10個(gè);apoE(-/-)市售品組斑塊數(shù)量9個(gè)。

3 討論

現(xiàn)在多采用apoE(-/-)小鼠來(lái)研究AS。因此目前它已成為研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞與分子機(jī)制和研究治療手段的極佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

采用基因敲除(基因打靶)技術(shù)建成的apoE基因敲除小鼠動(dòng)物模型，促進(jìn)了對(duì)高脂血癥和AS發(fā)病機(jī)制以及藥物干預(yù)措施等方面的新探索，成為目前在AS研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的基因工程動(dòng)物。西藥對(duì)apoE基因敲除小鼠AS的干預(yù)，已報(bào)道α-受體阻滯劑(哌唑嗪)、血管緊張素受體拮抗劑(氯沙坦)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)、調(diào)脂藥(他汀類(lèi)藥物如普伐他汀、辛伐他汀等，普羅布考)、雌激素等，取得較多研究成果〔4，5〕。中醫(yī)藥對(duì)apoE基因敲除小鼠AS的干預(yù)在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的研究就更少了。

本實(shí)驗(yàn)用普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠與apoE(-/-)小鼠，試驗(yàn)周期為3個(gè)月，是為初步探討普洱茶對(duì)遺傳損傷(apoE基因缺失)所造成的高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，給予普通飼料，AS模型組與正常對(duì)照組血脂和主動(dòng)脈組織病理學(xué)上即出現(xiàn)明顯差異。至于給予apoE(-/-)小鼠高脂飲食所引起的遺傳飲食復(fù)合型AS動(dòng)物模型，將有待深入研究。

普通飼料喂養(yǎng)條件下，C57BL/6J小鼠脂質(zhì)代謝正常，不會(huì)出現(xiàn)高脂血癥和動(dòng)粥樣硬化病變，而apoE(-/-)小鼠具有嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂和典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變。普洱生茶和普洱熟茶有降低高脂血癥的作用，其降血脂的作用可能與普洱茶中所含茶多酚及過(guò)程中產(chǎn)生的他汀類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。

與C57BL/6J小鼠體內(nèi)炎癥標(biāo)志物水平相比，apoE(-/-)小鼠體內(nèi)炎癥標(biāo)志物水平升高，普洱生茶和普洱熟茶有降低血清超敏C-反應(yīng)蛋白的作用，提示炎癥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展可能起著重要的作用，抑制炎癥有望控制AS的發(fā)生和發(fā)展。普洱生茶和普洱熟茶可降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，提示二者有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其具體作用機(jī)制還不甚清楚，除與抗脂質(zhì)過(guò)氧化外，可能還與抗炎癥有關(guān)。

1 劉龍濤，張文高，鄭廣娟.載脂蛋白E基因敲除小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用〔J〕.山東生物醫(yī)學(xué)工程，2002;21(4):39-42.

2 Smith JD，Breslow JL.The emergence of mouse models of atheroselerosis and their relevance to clinical research〔J〕.J Int Med，1997;242(2):99-109.

3 許淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:202-4.

4 Plum AS，Smith JD，Tony Hayek，et al.Severe hypercholesterolemia and atheroslerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES Cells〔J〕.Cell，1992;71(10):343-53.

5 高凌云，何作云，牟 嬌.羅格列酮對(duì)apoE基因敲除小鼠血漿高敏C-反應(yīng)蛋白水平的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2006;2(6):34-8.